[发明专利]一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用

说明书

本发明公开了一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用。所述成套引物对由引物对1‑引物对7组成，7个引物对的核苷酸序列如序列1‑14所示。所述东亚西番莲病毒全基因组测序是以感染东亚西番莲病毒样品的RNA为模板，利用7个引物对进行RT‑PCR扩增与测序。本发明的方法不仅可用于东亚西番莲病毒全基因组的扩增与测序，而且还可用于东亚西番莲病毒的快速检测与鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点。本发明也为东亚西番莲病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段，对于防控东亚西番莲病毒、保护西番莲生产安全具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用，适用于在农业生产和口岸植物检疫中东亚西番莲病毒的检测鉴定。

背景技术

西番莲(Passiflora edulia Sims)是一种芳香可口的水果，不仅具有较高的营养价值，同时还具有很高的经济价值。病毒病作为西番莲生产上的第二大病害，对西番莲的产量和品质造成了较大影响。东亚西番莲病毒属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒。该病毒是目前已明确报道能引起西番莲木质化病的主要病原之一，侵染西番莲后引起叶片花叶，果实斑驳、畸形和木质化等一系列症状。由于为害症状和血清学特性与西番莲上另一种为害较大的西番莲木质化病毒相近，早期一直被认为是PWV的一个株系，但其基因组的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列与PWV的一致性低于马铃薯Y病毒属的判断标准，因此被认定为一种新的病毒。

东亚西番莲病毒引起的西番莲木质化病造成的损失巨大，严重威胁西番莲的生产安全，但迄今为止尚无有效的防治药剂。加强病毒检测、及时采取防控措施是当前防治东亚西番莲病毒的主要途径。采用传统的鉴别寄主接种、血清学检测和电镜观察方法检测鉴定东亚西番莲病毒存在较大的局限性，无法对该病毒进行快速、准确鉴定，易出现假阴性或假阳性结果。RT-PCR检测东亚西番莲病毒具有特异性强、灵敏度高的优点，但已报道的方法主要针对某个基因片段，如CP基因序列进行检测和分析(谢丽雪等，园艺学报,2018,45(8)：1587～1594)。RNA植物病毒变异速度快，单个基因片段仅仅是东亚西番莲病毒全基因组的一部分，若该基因片段发生了较大的变异，仍有可能无法对该病毒进行准确检测，因此基于东亚西番莲病毒全基因组序列的鉴定方法更准确、更可靠。同时，东亚西番莲病毒全基因组的获得，对于进一步研究该病毒基因组结构和功能，科学防控东亚西番莲病毒、保护西番莲生产安全具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种东亚西番莲病毒全基因组测序和检测鉴定的方法，以实现快速、准确地检测鉴定东亚西番莲病毒，满足农业生产和口岸植物检疫的需要。

本发明首先保护用于东亚西番莲病毒全基因组测序和检测鉴定的成套引物对。

所述成套引物对由引物对1-引物对7组成；

所述引物对1由EAPV-S1-F和EAPV-S1-R组成；

所述引物对2由EAPV-S2-F和EAPV-S2-R组成；

所述引物对3由EAPV-S3-F和EAPV-S3-R组成；

所述引物对4由EAPV-S4-F和EAPV-S4-R组成；

所述引物对5由EAPV-S5-F和EAPV-S5-R组成；

所述引物对6由EAPV-S6-F和EAPV-S6-R组成；

所述引物对7由EAPV-S7-F和EAPV-S7-R组成；

所述EAPV-S1-F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；