[发明专利]一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用

权利要求书

1.一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，包括以下步骤：

(1)葡萄种植土壤样本采集及处理：对目标区域进行测量，采用五点采样法进行采样，取样土层25-35厘米。样本经粗处理后，采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。处理后纯化后，采用515F/806R PCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增。具体步骤详见本公司专利微生物肥料动态菌剂配方的配制方法和精准应用(专利号：2018103380602)

(2)测定目标区域土壤中微生物总量及微生物菌群比例：使用MP BiomedicalsFastDNA土壤样品提取试剂盒，测定目标土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例。

(3)制定个性化菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与自主建立的葡萄种植土壤生物信息数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，确定葡萄种植土壤的个性化菌剂配方。若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×10⁹cfu/g(mL)，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×10⁹cfu/g(mL)。

(4)发酵：将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:500稀释与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。

2.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：所述的步骤(1)中采用采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。

3.根据权利要求1或2所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：所述的步骤(1)中采用的515F/806R PCR引物为515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

4.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：种植葡萄土壤中的微生物菌群包括光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群、发酵系的丝状菌群、双歧杆菌、芽孢杆菌、根瘤菌、生孢梭菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、地表球囊霉菌、固氮菌等多种菌群，按照葡萄具体生长环境和检测结果，动态复合菌种配制而成。

5.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：通过选择葡萄种植土壤样本中常见多种菌株16S rRNA的微生物基因序列的测定，参照公共数据库(RDP、SILVA、GreenGene、UNITE)菌株的系统分类名称和DNA序列信息，自主构建葡萄种植土壤生物信息数据库分析和管理平台的方法。

6.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：所述的菌液发酵基质包括新鲜不同种类的天然植物块、茎、果实，分别洗净、切块/粉碎(长度1.5cm)并去除杂质后存放；按比例3：10(植物：水)加入纯净水。

7.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：菌液发酵基质中包括70％的水和8-13％的蔗糖(优选8％)，质量分数。

8.根据权利要求6或7所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：步骤(5)中发酵过程为：在25～30℃的温度下发酵7d后，没有大量气体产生时，密封发酵罐至少保持15-20d；当温度稳定后，且pH到达或接近5.0时显示发酵成熟，并冷却；发酵结束，过滤分离后得到个性化配方菌液。

9.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，将个性化配方菌液和待用载体充分混匀，干燥，造粒制成定制的微生态菌肥。