[发明专利]介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法

说明书

本发明公开了介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法，本发明从异足新米虾(Neocaridina heteropoda)卵黄蛋白原中找到了一段长度仅为40aa的多肽，该多肽具有出乎意料的介导外源蛋白内吞的效果，从而易于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，在异足新米虾的基因编辑中具有良好的应用前景。该技术的可被广泛应用于对胚胎显微注射技术尚不纯熟的非模式生物，对于Cas9介导的基因编辑具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及介导外源蛋白内吞的多肽和核酸及其应用和在异足新米虾中进行基因编辑的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromicrepeat/Cas9)系统是目前基因组编辑领域最受欢迎的方法。CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中，CRISPR的酶切位点通常由高度保守的重复序列组成，其长度为21-48bp，重复序列之间被26-72bp间隔序列隔开，这些间隔序列是CRISPR与靶基因进行识别的标记。Cas9存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在sgRNA(small guide RNA)引导下对靶位点邻近的PAM(protospacer adjacent motif)序列进行识别并在其附近切割。

在使用CRISPR-Cas9系统进行位点特异性基因编辑以来，该技术已被用于各种物种。成功应用CRISPR-Cas9进行基因编辑依赖于胚胎显微注射。然而对于非专业实验室而言，它需要昂贵的设备和培训才能实施。同时，许多非模型生物对该技术尚不纯熟，而且它们的卵在注射过程容易受损，这些极大地限制了CRISPR-Cas9技术在甲壳动物中的应用。

大多数雌性卵生动物通过卵巢和卵子成熟的保守过程将蛋白质物质传递给它们正在发育的卵巢，称为卵黄发生。在无脊椎动物中，卵黄蛋白前体(YPPs)在脂肪体或肝胰腺中合成，分泌到血淋巴中，并通过受体介导的内吞作用(RME)摄取到卵巢中。在卵黄发生过程中，卵母细胞膜中的多种受体结合YPP配体，内化，积累在内体囊泡中，并分选成卵黄颗粒，用于发育胚胎的营养储存。

假设来自甲壳动物YPPs的配体可以与Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物融合，并且将该融合蛋白注射到卵黄发生的雌性卵生动物血淋巴中，从而进入卵母细胞在胚胎中实现基因编辑。但是甲壳动物YPPs的分子量高达300kDa左右，将其整体作为YPP配体与Cas9融合后所形成的融合蛋白分子量过大，难于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，因此不具有实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能够高效介导外源蛋白内吞的多肽。

本发明的发明人在异足新米虾卵黄蛋白原的全长氨基酸序列中找到了一段长度仅为40aa的多肽，该多肽具有出乎意料的介导外源蛋白内吞的效果，从而易于表达、纯化、形成RNP复合物和被内吞，在异足新米虾的基因编辑中具有良好的应用前景，由此得到了本发明。

本发明提供了一种多肽，该多肽能够介导外源蛋白的内吞该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，所述外源蛋白为Cas9，所述内吞发生在异足新米虾卵母细胞中。

本发明还提供了一种核酸，该核酸编码如上所述的多肽。

可选地，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种如上所述的多肽或如上所述的核酸在介导外源蛋白内吞中的应用。

可选地，所述外源蛋白为Cas9，所述内吞发生在异足新米虾卵母细胞中。