[发明专利]一种枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉制备肌醇的方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备高浓度肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)构建敲除α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌宿主菌；

(2)在步骤(1)构建的宿主菌的基础上构建共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇-3-磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的工程菌、和/或分别表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇-3-磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的枯草芽孢杆菌工程菌；

(3)将步骤(2)构建的枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵获得全细胞；

(4)将步骤(3)获得的枯草芽孢杆菌全细胞进行细胞膜通透性处理，获得透性全细胞；

(5)利用步骤(4)获得的共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇-3-磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的透性全细胞，表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞，表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达耐热肌醇-3-磷酸合成酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单磷酸化酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇-3-磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的透性全细胞、表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的透性全细胞，表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的透性全细胞、表达耐热肌醇-3-磷酸合成酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单磷酸化酶的透性全细胞的混合物催化高浓度淀粉制备高浓度肌醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌包含共表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇-3-磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的载体；或者包含表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的载体、或者包含表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的载体、或者包含表达耐热肌醇-3-磷酸合成酶的载体、或者包含表达耐热肌醇单磷酸化酶的载体。

优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将淀粉转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)功能的酶。进一步优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于嗜热微生物或所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热α-葡聚糖磷酸化酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotogathermarum、Thermococcus kodakarensis。

优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-1-磷酸(G1P)变位为另一中间体葡萄糖-6-磷酸(G6P)功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热微生物或所述耐热葡萄糖磷酸变位酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸变位酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis。

优选地，所述耐热肌醇-3-磷酸合成酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有葡萄糖-6-磷酸(G6P)异构化为肌醇-1-磷酸(I1P)功能的酶。进一步优选地，所述耐热肌醇-3-磷酸合成酶来源于嗜热微生物或所述耐热肌醇-3-磷酸合成酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热肌醇-3-磷酸合成酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotogathermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus。

优选地，所述耐热肌醇单磷酸化酶为在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有肌醇-1-磷酸(I1P)脱掉磷酸基团为产物肌醇(Inositol)功能的酶。进一步优选地，所述耐热肌醇单磷酸化酶来源于嗜热微生物或所述耐热肌醇单磷酸化酶的氨基酸序列与来源于嗜热微生物的耐热肌醇单磷酸化酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。更优选地，所述嗜热微生物选自嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotogathermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus。

优选地，所述共表达的载体包括启动子、耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、耐热肌醇-3-磷酸合成酶基因、耐热肌醇单磷酸化酶基因和终止子；所述表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶的载体包括启动子、耐热α-葡聚糖磷酸化酶基因、终止子；所述表达耐热葡萄糖磷酸变位酶的载体包括启动子、耐热葡萄糖磷酸变位酶基因、终止子；所述表达耐热肌醇-3-磷酸合成酶的载体包括启动子、耐热肌醇-3-磷酸合成酶基因、终止子；所述表达耐热肌醇单磷酸化酶的载体包括启动子、耐热肌醇单磷酸化酶基因、终止子。

优选地，所述启动子包括但不限于P43启动子、Pylb启动子、PamyL启动子、Plaps启动子、PhpaII启动子、PamyE启动子、Pgrac启动子等。更优选地，本发明的启动子选择PhpaII启动子和Pylb启动子串联。