[发明专利]一种枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉制备肌醇的方法

说明书

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备高浓度肌醇的方法，包括构建共表达或单独表达耐热α‑葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热肌醇‑3‑磷酸合成酶和耐热肌醇单磷酸化酶的工程菌和/或工程菌混合物，并将工程菌和/或工程菌混合物进行细胞膜通透性处理，然后利用透性工程菌和/或透性工程菌混合物将淀粉转化为肌醇。本发明的方法与现有生产肌醇的方法相比，具有全细胞循环使用、安全性能高、产率高、生产工艺简单、成本低且易于规模化制备等优点。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及利用枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备生产高浓度肌醇的方法，属于肌醇的制备领域。

背景技术

肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素B族中的一种，广泛应用于饲料、食品、医药等行业。在饲料中加入0.2-0.5％的肌醇，可以有效的促进牲畜生长和防止死亡。在金鱼养殖过程中添加肌醇可明显提高金鱼游动能力，在鱼虾饲料中添加一定数量的肌醇，可促进鱼虾的生长，使鱼虾生长速度提高10％以上。肌醇是人，动物与微生物生长的必需物质，所以肌醇常作为营养强化剂应用于保健品，饮料(红牛功能饮料)和奶制品中，美国在1987年即推荐婴儿食品中应加入一定的肌醇。含肌醇的减肥降脂健美食品和营养保健品风靡欧美。肌醇还有很好的药用价值，能促进肝和脂肪的代谢，治疗各种维生素缺乏症，被广泛用于制造复合维生素制剂原料，可治疗肝硬化、脂肪肝、血管硬化、胆固醇过高、肥胖症、糖尿病和四氯化碳中毒等多种疾病，具有促进细胞生长和防止老化的医疗作用。肌醇作为制药中间体，可用来合成烟酸肌醇酯、脉通、肌醇硒酸酯等药物，以治疗胆固醇过高症、动脉硬化、糖尿病、癌症等。其中，肌醇硒酸酯被称为微量元素中的“抗癌之王”，可用于制备富硒抗癌药物、食品、饮料。近年来开发出来的新产品氟代肌醇具有抗癌、治癌和提高免疫功能。肌醇及其衍生物还可通过一种不同于血液的复合胺再吸收抑制因子治疗忧郁症和强迫性错乱症。

目前肌醇的化学生产主要还是传统的高温加压水解植酸(六磷酸肌醇)。该工艺设备材质要求严格，一次性投资大，操作压力只能控制在一定的范围内，限制了原材料利用率的提高，且粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，而且该工艺会产生大量的磷酸污染物，对水源，环境污染严重。

有文献及专利报道，利用微生物发酵法以葡萄糖为底物生产肌醇。在大肠杆菌中导入来源于酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶，以及过表达大肠杆菌自身的肌醇单磷酸化酶，从而使葡萄糖转化生产肌醇。但是微生物细胞中葡萄糖作为底物同时参与多个代谢反应用于维持细胞代谢；此外葡萄糖-6-磷酸通过葡萄糖磷酸化得到，需要消耗能量(ATP或者磷酸烯醇式丙酮酸)，葡萄糖转化为肌醇的转化率较低，除此之外，大肠杆菌含有内毒素，大肠杆菌作为宿主生产的产品在食品制剂行业的应用受到限制。

张以恒和游淳发明一种肌醇的酶催化转化方法(CN106148425A，肌醇的制备方法)，该方法提供了一种肌醇的酶催化转化方法，通过体外多酶催化淀粉或纤维素以及它们的衍生物和葡萄糖生产肌醇的方法，该方法具有肌醇产率和转化率高等优点。但是该方法中关键酶的发酵生产宿主是大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌本身含有内毒素不适合作为食品制剂的生产相关酶的生产菌株进行工业化生产，除此之外体外酶分离纯化步骤繁琐，酶回收利用率低，循环使用困难，无法进一步降低生产成本。除此之外，该方法所述底物淀粉的浓度为10g/L，底物浓度非常低，产物肌醇的产量更低，无法实现工业化高浓度产物大批量生产应用。

因此，亟待开发一种全细胞循环使用、安全性能高、产率高、生产工艺简单、成本低且且适用于高底物浓度投放和高产物肌醇产出，易于规模化制备肌醇的新方法。

发明内容

针对现有的多酶催化制备肌醇的方法所存在的问题如大肠杆菌含有内毒素不利于食品制剂的工业化生产，纯化步骤繁琐，酶回收利用利用率低和循环使用困难，以及低浓度底物淀粉的投料问题，本发明的主要目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备生产高浓度肌醇的方法，该方法具有全细胞循环使用，生产全过程安全可靠，工艺简单、生产成本低、投料浓度高和产量产率高等优点。