[发明专利]一种骨髓间充质干细胞的制备方法

说明书

一种骨髓间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞制备领域，本发明包括：将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。本发明采用梯度离心贴壁结合两轮抗体正向筛选法从骨髓液中分离高纯度间充质干细胞，培养过程中无大量杂细胞，结合抗体的细胞不会被洗脱至细胞中，细胞功能不受影响。本发明的制备方法安全，并且纯化和扩增骨髓间充质干细胞能力强。

技术领域

本发明涉及干细胞制备技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我复制能力和多向分化能力，并且来源广泛，例如可来源于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等。间充质干细胞有三个显著的特点：1、体外培养的间充质干细胞是贴壁生长的。来源广泛，易于提取，可大量扩增。2、间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD31、CD34、CD45、HLADR、CD14、CD19和CD11b等标志物。3、在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)既往称为骨髓基质成纤维细胞，是存在于骨髓中的一类非造血干细胞。骨髓间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。骨髓间充质干细胞具有间充质干细胞的普遍特性：1、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。2、具有免疫调节和修复组织损伤的特殊功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能，并通过释放细胞因子促进组织修复。3、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。4、骨髓间充质干细胞低度表达MHC-Ⅰ分子，不表达MHC-Ⅱ分子和B7-1、B7-2等共刺激分子，具有很低的免疫原性，能逃脱宿主免疫系统的排除。因此，骨髓间充质干细胞是一种具有巨大临床应用潜力的种子细胞。近年来，国内外已经开展了利用骨髓间充质干细胞的多项临床试验，例如治疗心肌梗死、脊髓损伤、糖尿病、系统性红斑狼疮、肝硬化和膝骨关节炎等疾病。

常规获取骨髓间充质干细胞的方法主要有以下几种：①贴壁分离法：利用MSCs贴壁生长的性质将其分离；②密度梯度离心法：利用Ficoll或者Percoll分离液通过密度梯度离心将MSCs和其他细胞分离；③免疫磁珠法：利用能结合MSCs表面特有标志物的抗体将MSCs和其他细胞分开。

贴壁分离法和密度梯度离心法虽然操作简单，但是分离得到的间充质干细胞纯度不高，杂细胞会伴随着间充质干细胞一起增殖，从而逐渐降低间充质干细胞的纯度和生长速度。传统的免疫磁珠法是先用抗体结合间充质干细胞，然后再用磁珠和磁场分离得到纯化的间充质干细胞。免疫磁珠法能得到纯度很高的间充质干细胞，但是抗体和磁珠会结合在间充质干细胞的表面，对细胞有损伤，也可能会非特异性激活目标细胞或者影响目标细胞在下游实验中的功能。

发明内容

为了解决现有骨髓间充质干细胞的制备方法存在的诸多问题，本发明提供一种骨髓间充质干细胞的制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：