[发明专利]一种骨髓间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、用50mM的磷酸盐缓冲溶液分别溶解CD73抗体和CD90抗体，使其浓度为10～20μg/ml，2ml/皿加入到100mm细胞培养皿中，4℃放置过夜；

步骤二、第二天弃去包被液后，用PBS清洗3次，每个皿中加入2ml人血白蛋白，37℃封闭1h；

步骤三、用PBS清洗3次，留存待用；

步骤四、取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管中，同时振荡离心管，使肝素和骨髓液迅速混合；

步骤五、向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液；

步骤六、将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min；

步骤七、弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀；

步骤八、按照骨髓液与分离液1:2的体积比例将细胞悬液沿50ml离心管壁加入比重为1.077的Ficoll分离液；

步骤九、700g离心30min；

步骤十、取中间层细胞，转移至无菌离心管内，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min；

步骤十一、弃上清，加入生理盐水1800r/min离心10min，清洗两次；

步骤十二、用含有血清替代物的完全培养基重悬细胞并进行细胞计数；

步骤十三、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD73抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十四、培养48～72小时后半量换液，弃去未贴壁细胞，得到纯化的骨髓间充质干细胞；以后每隔3天半量换液1次；当细胞融合达到80％时进行传代；

步骤十五、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min；

步骤十六、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD90抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十七、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min，得到高纯度的骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求1或2所述的制备方法制备的骨髓间充质干细胞。