[发明专利]一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法

权利要求书

1.一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：其经过以下步骤：

（1）原料预处理：将新鲜鱿鱼眼粉碎，加入其2-5倍重量的丙酮，静置10-15min，离心除去丙酮，得到鱿鱼眼原料；

（2）透明质酸提取：称取步骤（1）中得到的鱿鱼眼原料，加入其5-10倍重量、质量分数为1-15%的月桂醇聚醚硫酸酯铵水溶液，不断搅拌，收集产生的气泡，在收集的气泡中加入气泡重量2-5倍的、质量浓度95%的乙醇，同时用酸溶液调节pH值为5-6，充分搅拌，离心收集沉淀，并用丙酮反复冲洗，得粗透明质酸；

（3）除杂：将步骤（2）中得到的粗透明质酸用超临界二氧化碳处理；选取处理后剩余物料，加入等质量的蒸馏水，同时加入蒸馏水重量2-6%的蛋白酶，酶解并在结束后灭活，离心，取上清液；

（4）透明质酸小分子化：将步骤（3）中得到的上清液中加入质量分数为3-5%的透明质酸酶，搅拌，酶解条件为：pH值6-8，酶解温度30-40℃，酶解时间30-90min，酶解结束后离心，取上清液；

（5）透析、干燥：将步骤（4）中得到的上清液转移至透析袋中，经过两步透析，在室温下共透析20-24h，取第二步透析的去离子水，加入其1-3倍体积的、质量浓度95%的乙醇，静置，离心，取沉淀，冷冻干燥，即得透明质酸。

2.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述的酸溶液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液中的一种或两种以上。

3.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的超临界二氧化碳处理的条件为：压力控制为20-25MPa，温度控制为20-30℃，二氧化碳流速15-20 kg·h-1，处理时间20-25min。

4.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的蛋白酶由胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶组成，两种酶添加比例为1:1。

5.根据权利要求1或4所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的酶解的条件为：酶解温度40-50℃，酶解时间60-180min，pH值6-8。

6.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的透明质酸酶的制备方法为：

（s1）选取新鲜鱿鱼眼，粉碎后放入25-35℃培养箱中，自然发酵10-24h；

（s2）过滤取滤液；

（s3）滤液中加入95%乙醇，离心取沉淀，沉淀用去离子水复溶、离心，并重复3遍，得沉淀；

（s4）取含10-30%透明质酸的液体培养基，按培养基重量接种5-10%的、步骤s3）中得到的沉淀，在温度25-35℃，培养10-24h，离心，取上清液，即获得透明质酸酶。

7.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法，其特征在于：在步骤（5）中，所述的两步透析，选择不同截留分子量的透析袋，其第一步用透析袋截留分子量为1000Da的透明质酸，透析时间10-12h；其第二步透析是将透析液转入截留透明质酸分子量为40000Da的透析袋，放入去离子水中，透析时间10-12h，最后收集去离子水。