[发明专利]一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其包括以下溶液：溶液A：β‑巯基乙醇；溶液B：1～2g/L的Tris、1.5～2.5g/L的2％十六烷基三乙基溴化铵、8～9g/L NaCl、0.5～1g/L EDTA，pH为5.3～5.5；溶液C：18～22g/L乙酸钾；溶液D：乙醇；溶液E：氯仿；溶液F：异丙醇；溶液G：75％乙醇；溶液H：DEPC水。采用该试剂盒可以从铁皮石斛中分离得到RNA，提取得到的RNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序，并且操作简单，可大大缩短实验时间。本发明的试剂盒还适用于其它富含水溶性多糖、多酚、淀粉的植物材料的RNA提取。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及方法。

背景技术

进行植物基因克隆、Northern杂交分析、cDNA文库构建、RT-PCR和Realtime PCR等分子生物学的研究时，通常需要得到完整的RNA。近年来兴起的高通量测序，对RNA的质量和浓度要求更高，RNA浓度要求大于200ng/ul，总量大于15ug。所以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA，是顺利进行上述实验研究的关键。

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属草本植物，因其茎节处呈黑褐色，又称黑节草，是我国传统珍贵药材之一，与人参、天山雪莲、灵芝等并称为中华九大仙草。现代研究表明，铁皮石斛具有抗肝损伤、增强免疫、促消化、抗疲劳、降血糖、促进唾液分泌、降血压等功效。铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、微量元素和菲类化合物等多种活性成分，其中多糖为其主要的活性成分，也是其中含量最高的物质。铁皮石斛组织中水溶性多糖含量较高，从中提取RNA非常困难，这是因为植物组织中水溶性多糖的理化性质与RNA相似，溶于水而不溶于无水乙醇、异丙醇等有机溶剂，因此很难将水溶性多糖和RNA分开。而多糖也可以抑制许多酶的活性，污染了的水溶性多糖的RNA样品就无法用于进一步的分子生物学研究。另外，富含多酚类的植物，在植物组织受到破坏后，就会释放出大量的酚类物质，酚被氧化而形成的褐色醌类物质能与RNA稳定结合；富含淀粉的植物，在提取RNA过程中淀粉也很难与RNA分离。因此，很难从富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物材料(如富含多糖的药用植物铁皮石斛、茯苓和黄精)中分离提取到高纯度、高浓度完整的RNA。

目前常用的RNA提取方法有CTAB法、SDS法、天泽RNAOut2.0等。CTAB法操作步骤大致如下：将冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎(通常的做法是加液氮使材料变脆，易于研磨)，低温降低了DNase的活性，利于CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来，该方法存在RNA降解的问题，提取效率低；改良SDS法提取RNA主要用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)等离子型表面活性剂，使蛋白变性，最后加入无水乙醇沉淀DNA，沉淀的DNA，即为植物的总DNA，溶于TE溶液中保存备用，使用改良版SDS法对植物进行提取时，提取过程中溶液会粘稠成团，无法摇匀，无法进行下一步实验；使用一步法质粒RNAOut2.0(上海信裕生物科技有限公司柱式植物RNAout2.0)进行提取直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品，不需要裂解红细胞等任何预处理步骤，整个提取只需要10min左右，可以全在室温下进行，在水溶性多糖含量低于20％时可以提取到，但效率较低，只能满足一些常规实验，无法满足高通量测序的需求，当水溶性多糖含量更高时，水溶性多糖会与RNA缠绕在一起堵住滤膜，无法洗脱；使用低浓度乙醇处理、氯化铿沉淀法等来去除水溶性多糖，但都会使提取效率大大降低。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术中的不足，提供一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及相应的提取方法，该方法能够从铁皮石斛中分离到纯度高且完整性好的RNA。

技术方案

一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其包括如下组分：

(1)溶液A：β-巯基乙醇；