[发明专利]一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用

说明书

本发明公开了一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用，将5＇端磷酸化的DS DNA在T4 DNA连接酶和ATP的作用下，制备得到哑铃型DNA，进一步在哑铃型DNA的基础上制备结合了铜钠米粒子的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，并且随着加入的三磷酸腺苷浓度的增大，哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度随之增大，从而构建ATP浓度与荧光强度之间的线性关系，实现了对三磷酸腺苷的高灵敏性、特异性的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低的优点。

技术领域

本发明属于荧光传感制备技术领域，具体涉及一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种多功能的核苷酸，它不仅是一个普遍的能源，而且也是一种细胞外信号传导介质，涉及许多生物过程包括膜离子通道，DNA复制，生物合成，也被用作生物体的细胞活性和细胞损伤指标。因此，在生化研究以及临床诊断方面应用广泛,对于ATP的高灵敏和高选择性的检测是必不可少的。目前已经开发了对于ATP检测的策略，许多基于主-客体，肽，共轭聚合物，DNA/RNA适配体和ATP依赖的连接反应，即使有一些方法表现出非常好的分析性能，他们通常涉及到信号标记，且时间比较长，成本较高。基于此，我们通过实验探究设计并提出了一个最佳发光体哑铃型(DS)的DNA模板结构，用来生长CuNPs，以此作为荧光探针，实验ATP的高灵敏检测。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用，将5＇端磷酸化的DS DNA在T4 DNA连接酶和ATP的作用下，制备得到哑铃型DNA，进一步在哑铃型DNA的基础上制备结合了铜钠米粒子的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，其可实现对于ATP的高灵敏性检测。

本发明采取的技术方案为：

一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将5＇端磷酸化的DS DNA溶液在缓冲溶液中，然后加入T4 DNA连接酶和ATP，反应50～60min，得到哑铃型DNA溶液；

(2)将步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液加入到缓冲溶液中，再加入Cu²⁺溶液和抗血酸钠溶液，混合均匀并反应至少5min，即可得到哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器。

所述5′端磷酸化的DS DNA的基因序列为：

5’-PO₄-ATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATAT-3’。

所述步骤(1)之后还包括：向所述的哑铃型DNA溶液中加入Exo I和Exo III，反应60min，然后于80℃孵育5分钟。通过Exo I和Exo III的加入证明本发明制备的哑铃型DNA不会被Exo I和Exo III破坏。

步骤(1)中，所述5′端磷酸化的DS DNA溶液、缓冲溶液、T4 DNA连接酶、ATP的体积之比为50:144:1:5；所述5′端磷酸化的DS DNA溶液的浓度为1μM；所述T4 DNA连接酶的浓度为350U/μL。

所述缓冲溶液为PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液。

步骤(2)中，所述哑铃型DNA溶液、缓冲溶液、Cu²⁺溶液、抗血酸钠溶液的体积之比为1:1:1:1；所述哑铃型DNA溶液的浓度为1μM；所述Cu²⁺溶液的浓度为0.8mM；所述抗坏血酸钠的溶液的浓度为8mM。