[发明专利]一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法

说明书

本发明涉及一种利用糖蜜高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，该方法以酿酒酵母为发酵菌种，以糖蜜为碳源、羽毛水解粉等为氮源，在发酵过程采用多级变速流加碳源、氮源和磷源的方法进行发酵，并在规定的时间内恒速流加一定配比的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，不添加ATP，发酵34‑36小时，酵母细胞干重达到50‑90g/L，谷胱甘肽产量高达10000‑16000mg/L，实现谷胱甘肽的高密度培养。

技术领域

本发明涉及一种利用酿酒酵母高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，特别涉及一种利用农副资源高密度发酵合成谷胱甘肽的方法。

技术背景

谷胱甘肽（GSH）是一种由甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸组成的三肽化合物，谷胱甘肽具有还原型和氧化型两种形式，两分子还原性谷胱甘肽的巯基(-SH)经氧化脱氢得到氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽具有生理活性，例如其较好的抗氧化性和清除自由基作用，在治疗肿瘤、癌症、中毒和抗辐射等方面有明显的治疗效果。因此，高谷胱甘肽含量的酿酒酵母在医疗、食品、化妆品及动物保护等领域具有广泛的市场前景。

总的来说谷胱甘肽的生产方法主要包括萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中萃取法原料主要来源于动植物组织，具有难以获得且含量极低的缺点；化学合成法主要是通过化学的方法将三种前体氨基酸合成GSH，但操作复杂，分离纯化困难，纯度低，环境污染严重；其中酶法合成主要利用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHⅠ）和谷胱甘肽合成酶（GSHⅡ）在ATP的存在下催化三种氨基酸合成谷胱甘肽，但该方法成本太高，不适合大规模生产，综上所述发酵法工业化大规模生产谷胱甘肽最具潜力、最实用的方法，因为其方法简单、成本低、污染小。但目前国内谷胱甘肽的发酵生产存在以下几个方面的问题：1、野生型产谷胱甘肽微生物谷胱甘肽合成产率低；2、酵母高密度发酵合成谷胱甘肽过程中的代谢调控不完善，发酵周期长；3、谷胱甘肽的合成和酵母细胞的生物量没法同时达到较高水平4、谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，导致在谷胱甘肽提取过程中损失大。由于这些因素的制约，使谷胱甘肽的生产受到很大的影响。

谷胱甘肽的发酵生产已有一些报道，如：专利CN1450168，以产朊假丝酵母WSH02-08为菌株，以葡萄糖为主要碳源，在发酵过程中一次性添加L-半胱氨酸，在7L发酵罐中发酵24h，细胞干重14-16g/L，干细胞谷胱甘肽含量400-520mg/L，其生物量和谷胱甘肽含量均较低。专利CN101235405，以葡萄糖为主要碳源，在7L发酵罐中发酵30h，谷胱甘肽含量320mg/L。专利CN101245363，以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、 L-谷氨酸，在7L发酵罐中发酵92h，谷胱甘肽含量650mg/L。专利CN101429537以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、 L-谷氨酸，发酵42h，生物量128g/L，谷胱甘肽含量2080mg/L。专利CN101824451A，以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期大量流加葡萄糖，发酵48h，生物量91.2g/L，谷胱甘肽含量825.0mg/L。专利CN101880702A，以葡萄糖为主要碳源，在发酵过程中中滴加复合维生素B和含硫氨基酸，发酵65-75h，谷胱甘肽含量7000-10000mg/L。专利CN103014104A，以巴斯德毕赤酵母Pichia.pastoris SL1220为菌株，在发酵后期流加L-半胱氨酸，在50L发酵罐中发酵55h，谷胱甘肽含量5840mg/L。

甘蔗糖蜜又称糖浆，是制糖工业将压榨出的甘蔗汁液，经加热、中和、沉淀、过滤、浓缩、结晶等工序制糖后所剩下的浓稠液体，是糖厂的副产品之一。甘蔗糖蜜成分复杂，包括蛋白质、维生素、有机酸和一些金属离子，且含糖量很高，一般占到 30 %～50 %，是发酵、饲料、食品和建筑行业中常见原料，但其中还混有大量的非糖成分和杂质，如含有5 %～10%的胶体物质（主要由果胶质、焦糖和黑色素等组成），会降低发酵效率，色素、重金属和糠醛等物质也会对酵母的生长繁殖产生不利的影响。目前酵母生产谷胱甘肽的培养基主要以葡萄糖为碳源，后期还要流加氨基酸前体，导致生产成本过高，企业利润空间低。