[发明专利]一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法

权利要求书

1.一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）酿酒酵母接种于试管斜面上活化，30℃培养40-48h，然后将活化后的酿酒酵母接入液体种子培养基中，28-32℃，180-200rpm振荡培养20-24h，得到高活性酵母细胞；

（2）糖蜜进行预处理，过滤分离，取滤液加入体积质量浓度0.001-0.005%的硫化钠，充分搅拌30-50分钟，静置1-2小时，再过滤分离，取滤液先加入果胶酶50℃反应1-2小时，然后再加入木瓜蛋白酶反应2-3小时，稀释至含糖量为26%～28%，最后用酸调节pH至5.0～6.0，混合均匀，备用；

所述果胶酶的用量为：每升滤液中加入10-30U的果胶酶；

所述木瓜蛋白酶的用量为：每升滤液中加入25-55U的木瓜蛋白酶；

所述果胶酶、木瓜蛋白酶的酶活分别为4000U/g、 2000U/g；

（3）羽毛水解粉的制备：用剪刀将羽毛剪成小段，加入羽毛质量2倍的水，在120-150℃下处理1-3小时，再加入羽毛质量2倍的水，待温度降至40-60℃后，按1Kg羽毛加入1000-1500U的角蛋白酶，在50-55℃、pH5.5-6.5条件下酶解2-3小时，升温至90-100℃维持30-50分钟，得到羽毛水解液，水解液喷雾干燥后即为羽毛水解粉；

（4）将步骤（1）的活性酵母细胞接种于发酵罐中发酵， 28～32℃，发酵23～36h，当生物量湿重达到150-170g/L时开始流加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，控制流加速度在4-6小时内流加完毕，且整个发酵过程多级变速流加碳源、氮源、磷源，发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%；

所述流加碳源为糖蜜、葡萄糖；

所述流加氮源为羽毛水解粉、硫酸铵；

所述流加磷源为磷酸二氢铵。

2.如权利要求1所述的一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的活化斜面培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，pH 5.5-6.5；

所述液体种子培养基为：蔗糖 50g/L，酵母粉20g/L，磷酸二氢钾 1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，pH 6.0-6.5。

3.如权利要求1所述的所述的一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的谷氨酸浓度为4-6mmol/L、半胱氨酸浓度为4-6mmol/L、甘氨酸浓度为2-5mol/L。

4.如权利要求1所述的一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述步骤（4）中多级变速流加碳源、氮源、磷源的方法为：

在50L发酵罐中，流加碳源为糖含量27%的糖蜜及浓度为290 g/L的葡萄糖，发酵前期0-7小时，糖蜜的流加速度为：20mL/h～100mL/h，通风0.5-1.5 m3/h，转速100-400 rpm;发酵中期8-26小时，糖蜜的流加速度为：100mL/h～650mL/h，通风2.0-4.0 m3/h，转速400-600rpm;发酵后期27-34小时，糖蜜的流加速度为：250mL/h～300mL/h，同时流加葡萄糖：250mL/h～480mL/h，溶氧量控制在10-20%，发酵最后阶段，34-36小时，停止流加碳源；

流加氮、磷源的配方为尿素80g/L、硫酸铵35g/L和磷酸二氢钾60g/L；发酵0-24小时，氮、磷源的流加速度为100mL/h～150mL/h，发酵后期24-34小时，停止流加磷源，只流加氮源：60mL/h～100mL/h；

发酵到30-32小时，生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L，控制流加速度，在4-6小时内流加完毕；

在200M3发酵罐中，多级流加发酵：发酵温度28-32 ℃，发酵周期23 h，发酵前期0-13小时，糖蜜的流加速度为：800L/h～4000L/h，通风3500-10000 m3/h，发酵后期13-22小时，糖蜜的流加速度为：2000L/h～4000L/h，通风2000-5000 m3/h，发酵最后1小时停止流加，空耗1小时；

发酵0-24小时，氮、磷源的流加速度为100mL/h～150mL/h，发酵后期24-34小时，停止流加磷源，只流加氮源：60mL/h～100mL/h；

发酵到30-32小时，生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L，控制流加速度，在4-6小时内流加完毕，整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%。