[发明专利]一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明以肝素黄杆菌肝素酶HepI基因为目的基因，成功构建肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌，实现在16℃低温下诱导重组肝素酶的可溶性表达。本发明的方法提高了肝素酶的表达量，简化了重组酶的分离纯化步骤，降低成本，所得重组肝素酶具有较强的降解肝素的活性，在酶法制备低分子肝素的生产中具备非常诱人的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及肝素酶基因工程表达产物及其制备方法。

背景技术

肝素是一类由葡糖胺和葡糖醛酸为二糖单位组成的长链糖胺聚糖，由于其具有良好的抗凝血作用，临床上主要作为预防血栓或体外抗凝药使用。低分子肝素是从普通肝素中分离得到低分子量组分或裂解肝索产生的片段，其分子量在4000Da-6500Da，是新一代肝素类抗血栓药物。低分子肝素因分子量小，不易被第1v因子中和，抗凝效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板、影响血小板功能、影响血液凝固性、诱发出血的作用大为减弱，并且其生物利用度高、血浆半衰期长、口服易吸收、不易透过胎盘屏障，同时具有快速和持续的抗血栓形成作用，因此颇受临床青睐，近年来在防治深部静脉血栓、肺栓塞治疗等方面发挥着越来越重要的作用，其作为抗凝血药物在临床上的应用比例亦越来越大。

目前国内外低分子肝素制剂已经有10多个品种问世，临床上使用较多的品牌如葛兰素史克的“速碧林”、赛诺菲的“克赛”等。但就肝素类药物价格来说，低分子肝素尤其是一些进口的低分子肝素产品的价格却远远高于普通肝素类药物。尽管低分子肝素类药物有着诸多的优点，但过高的价格无疑给使用者带来了沉重的经济负担，因此，如何提高肝素的降解效率、制备理想分子量的低成本低分子肝素有着重要的研究和实践意义。目前工业生产低分子肝素的方法主要是化学降解和酶降解法。虽然化学降解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入的强氧化剂等会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，也破坏肝素的结构，而酶降解法由于其温和的反应条件、不引起肝素结构的破坏、无毒性、易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。

酶降解法生产低分子肝素所使用的酶即肝素酶。肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶。在真核生物中，通常称作类肝素酶或乙酰肝素酶(heparanase)，其通过水解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)的肝素类侧链破坏细胞外基质和基底膜的基本结构，释放并激活连接在肝素类侧链上的活性物质，与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程密切相关。原核生物肝素酶I(Heparinase I)目前主要来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，在制备低分子肝素、消除体外循环中的肝素抗凝剂、确定肝素精确结构等方面有着重要的用途。 肝素酶具有重要的用途，尤其在低分子量肝素的生产和作为肝素体外循环中的肝素的去除。肝素酶的研究在我国起步相对较晚，到目前为止研究开展也并不系统和深入。由于肝素酶昂贵的价格，其结构的研究及在低分子量肝素的生产中的应用受到限制。利用基因工程方法制备肝素酶，对肝素酶的研究和应用发展将产生积极的推动作用。

已有的肝素酶基因工程制备方法和工艺，重组肝素酶在基因工程菌中是以包涵体方式表达，纯化时需要经过变性、复性等工艺，导致步骤多、活性低等缺点，最终由于产量低、价格高，限制了重组肝素酶在生产中的应用。本发明通过对工程菌培养条件，特别是工程菌诱导表达条件的优化，使得重组肝素酶以部分可溶的型式表达，其可溶性重组肝素酶的占比，达到了细胞总肝素酶含量的40%以上，比现有方法提高了40倍以上，这不仅大大提高了肝素酶的产量，而且简化了提取纯化的工艺步骤，降低了产品成本，为其商业应用提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法。该方法通过对重组肝素酶基因表达条件的优化，使重组肝素酶以可溶形式表达，提高了肝素酶的表达量，简化了重组酶的分离纯化步骤，降低成本。

一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，包括以下步骤：

（1） 肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因的克隆；