[发明专利]一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法

权利要求书

1.一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1） 肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因的克隆；

（2） 构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体；

（3） 将步骤（2）的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体转化进大肠菌宿主菌中，构建肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌；

（4）肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌中重组肝素酶的诱导表达；

（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组肝素酶蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因ORF编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；设计扩增编码HepI基因ORF的特异性上游引物F1:5’-AACCCGGGATGAAAAAACAAATTCTATA-3’和下游引物R1: 5’ -AAGCGGCCGCCTATCTGGCAGTTTCGCTGT -3’ ；在上、下游引物分别引入Sma I，Not I酶切位点；取肝素黄杆菌培养液到Ep管中，99°C裂解10 min，10,000 × g离心5min，取上清液作为PCR扩增的模板，然后以F1/R1为引物，PCR扩增获得肝素黄杆菌肝素酶HepI基因。

3.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体，具体为：取将肝素酶HepI基因与pGEX-4T-2质粒分别用Sma I，Not I酶切，回收酶切产物，酶切产物用T4 DNA连接酶，转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证、质粒双酶切验证、质粒测序鉴定，获得码框正确无误的肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载。

4.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌BL21。

5.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（4）肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌中重组肝素酶的诱导表达，具体为；肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌接种到 5mL 含100ug/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37°C下振荡培养过夜制得种子液，按种子液与培养基体积比为 1∶50 的比例将种子液接种到新鲜的1/2 LB液体培养基中, 37℃摇培至OD₆₀₀达到1.0~1.2后，转移至16℃，后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半苷，诱导剂的终浓度为0.25 mmol/L；继续摇培4~10 h进行目基因的诱导表达。

6.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述分离纯化为：离心收集步骤（4）诱导表达的菌体，加入预冷的15 mL 1×PBS缓冲液悬浮细菌，冰上超声裂解细菌； 裂解液离心后的上清液与Glutathione Sepharose 4B结合，将结合液装到层析柱上，用1×PBS洗去杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液的组成为：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L GSH，pH8.0。

8.一种如权利要求所述制备方法制备所得的重组肝素酶蛋白。

9.如权利要求8所述的重组肝素酶蛋白在生产低分子量肝素中的应用。