[发明专利]基于阻断型链式聚合扩增反应体外快速合成中高拷贝DNA重复序列

说明书

本发明提供一种合成包括重复单元的DNA序列的方法，所述方法包括基于所述重复单元设计和合成延伸引物和阻断引物，并且在PCR反应体系中通过使用所述重复单元(作为扩增模板)、延伸引物和阻断引物进行PCR扩增反应，获得所述包括重复单元的DNA序列。本发明还提供用于该方法的试剂盒。本发明的方法具有重复序列合成拷贝数量可控，合成步骤简单、成本低等特点，十分适合工业化高通量生产。

技术领域

本发明涉及DNA扩增技术领域，具体地涉及一种合成包括重复单元的DNA序列的方法。本发明还提供用于该方法的试剂盒。

背景技术

近年来随着测序能力的提升，许多物种的基因组信息被破解，大量重复DNA序列被陆续发现，且重复DNA序列的含量与物种进化成正相关，真核生物基因组中重复DNA序列的种类及含量远远大于原核生物，因此预示着重复DNA元件与生物进化，复杂生物学功能直接相关，具有非常强的生物学功能及研究意义。随着基因组学研究的深入，人们发现含有不同拷贝数量的DNA双链序列在重结合动力学特征上存在显著区别，重复单元含量和拷贝数量与重结合时间成负相关关系，因此根据动力学特征人们将DNA重复序列分为单拷贝重复序列；低度重复序列；中度重复序列和高度重复序列。中度和高度重复序列元件与染色体构建，结构维持和基因表达调整等生物学功能直接相关。另外由于中高度重复DNA分子之间具有极强亲和自组装能力，因此中高度重复双链DNA分子往往也是极佳的生物兼容性材料的构建基础分子。

综上所述，体外人工合成中高度重复DNA序列具有非常重要的生理学及材料学应用价值，现有体外合成中度及高度重复DNA的方法较为有限，主要以RCA(滚环型扩增)和基因合成拼接技术为主。

RCA技术主要借鉴病毒及原核生物质粒的环化扩增原理，通过连接酶将特定单链DNA分子进行环化连接，获得环化DNA模板分子，然后使用与环化模板配对的单链DNA引物及高效单链扩增酶(phi29)在等温环境下(25-37摄氏度)对环化模板进行循环复制，从而获得与环化模板互补配对的重复单链DNA序列(如图1所示)。该方法需要经过单链模板环化；未环单链DNA消除和环化扩增三步，操作步骤较为繁琐，且各个技术环所需生物活性酶费用较高，严重限制了该方法的产业化，另外最终产物为单链重复DNA分子，后期改进方法MCH需要额外添加更多的单链引物，从而获得DNA双链分子产物。RCA方法获得重复DNA分子拷贝数量与反应时间成正相关，即只能通过控制反应时间来控制最终产物的拷贝数量，在实际操作中产物长度难以预测性，难以精确控制产物重复序列的拷贝数量，缺乏实用性，故RCA扩增法合成中高度重复DNA一直停止在实验室应用阶段，难以产业化。

随着高通量DNA引物合成技术的成熟，重叠区扩增基因拼接法逐渐成为基因合成的主流(Gene SOE)。Gene SOE技术将长DNA片段分割成多级小片段，每个片段两侧存在特异识别碱基序列，通过碱基互补原则在连接酶或扩增酶的协作下完成多级小片段的顺序组装，最终获得长片段DNA基因序列(如图2所示)。重叠区域碱基长度及碱基配比，引物Tm值对整个拼接效率产生至关重要的影响。然而，由于高重复DNA序列当拷贝数量达到一定阈值时，DNA分子内部会产生碱基配对滑动及错配现象，严重影响扩增及连接效率，导致拼接效率下降，错误率增加等问题，最终导致拼接法合成中高度重复DNA周期较长，碱基突变率高和拷贝数量难以控制等问题，最终影响重复DNA双链的合成。

发明内容

为解决重复序列合成中所面临的高成本，周期长，错误率较高等问题，本发明人研发了一种新型的体外快速合成中高度重复序列的方法。