[发明专利]一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法

说明书

本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的提取方法中应用了LH液，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm²陈旧唾液斑(约20μL唾液)样品即可。本发明的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类长度为16～22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，能够与信使RNA的非编码区结合，从而导致基因沉默或抑制基因转录。miRNA在多种体液中广泛表达，包括羊水、乳汁、支气管液、脑脊液、初乳、腹膜液、血浆、胸腔液、唾液、精液、眼泪和尿。

作为一种重要的调控因子，miRNA的表达具有组织特异性，目前miRNA成为法庭科学领域新的体液斑鉴定标记物。特别是法医实际案例中的检材通常具有微量、易降解、成分复杂等特点。传统的法医DNA分析在腐败、降解检材等案件中的应用仍然有一定的局限性。而miRNA由于具有长度较短，不易降解等特点，其作为法医新遗传标记的研究具有可观的前景。

目前针对miRNA的分析方法主要有荧光定量PCR和高通量测序方法，高通量测序技术具有效率高，通量高，能有效检出基因多态性等特点，成为目前miRNA表达谱检测的主流方法之一。但是高通量测序方法所需模板量大，通常需要100ng以上总RNA，不适用于体液斑等痕量样本，且应用传统方法进行唾液斑miRNA提取，效率低，难以满足高通量测序的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，该唾液斑miRNA的提取方法提取效率高；该唾液斑miRNA高通量测序文库建立的方法能够显著缩短时间，且对样品的需求量小。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：

1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；

2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；

3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；

4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；

5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；

步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。

优选的，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm²；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。