[发明专利]一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法

权利要求书

1.一种唾液斑miRNA的提取方法，由以下步骤组成：

1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；

2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；

3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；

4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；

5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；

步骤2)中所述1.5×LH液由以下浓度的组分组成：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿由以下体积份的组分组成：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L；

步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为250μL，所述乙醇的用量为300μL；

以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量500μL。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm²；所述唾液斑样本所含唾液量和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为3～5mL：7～9mL：0.3～0.8mL。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。

5.权利要求1～4任意一项提取方法得到的唾液斑miRNA。

6.一种利用权利要求5所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：

S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；

S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；

S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmp Taq 2X MasterMix 50μL、SR引物2.5μL、Index X引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；

所述SR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述Index X引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。