[发明专利]肿瘤乳酸微环境相关非编码小RNA分子谱及其应用

说明书

本发明属生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及扩增和分析人类细胞编码的hsa‑miR‑9‑5p，hsa‑miR‑210‑3p，hsa‑miR‑7‑5p，hsa‑miR4521，hsa‑miR‑7974和tiRNA^HisGUG，以及其表达情况，和应用于预测。本发明提供了一种定量小分子RNA的方法，该方法包括以下步骤：(1)收集样本；样本处于含有乳酸的环境，乳酸的浓度范围是100‑250U/L；(2)茎环法定量PCR；(3)获得目标miRNA分子或者5’‑tiRNA分子。本发明还提供了目标小分子RNA的应用，为恶性淋巴瘤的预后效果和治疗提供了新的工具。

技术领域

本发明属生物化学与分子生物学领域，具体涉及扩增和分析人类细胞编码的hsa-miR-9-5p，hsa-miR-210-3p，hsa-miR-7-5p，hsa-miR4521，hsa-miR-7974和tiRNA^HisGUG，以及其表达情况，和应用于预测恶性淋巴瘤的预后效果和治疗。

背景技术

现有技术公开了小分子RNA包括microRNA(miRNA)、转运RNA(tRNA)、Piwi蛋白相关RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)等。miRNA是一类长度在18-25nt左右的非编码小RNA，在生物体内的表达具有时序性，保守性，组织特异性和疾病特异性，可通过与靶基因互补结合，负调控mRNA的表达，在细胞增殖分化、凋亡、胚胎发育、血管生成等多种生命活动中发挥作用，可作为肿瘤诊断性、治疗性、预测性的生物标记物。

研究表明了肿瘤微环境(tumor microenviroment,TME)是肿瘤细胞赖以生存的复杂内环境，由肿瘤细胞和其周围环境共同组成，其特点是酸性，低氧，低PH值。临床实践中，对淋巴瘤的临床诊断和预后判断主要通过有创的淋巴结切除活检并结合免疫组化等进行，由于其发病部位可出现在全身淋巴结内或结外任何组织，病理标本不易获取；另外，淋巴瘤病变部位常伴有感染、坏死等情况，导致病理诊断困难，需多次活检。因此寻找能够反映淋巴瘤酸性微环境的生物标志物，建立创伤小、高特异性、高灵敏性的检测方法对淋巴瘤诊断和治疗极其重要。

tRNA半分子(tRNA halves,tiRNA)是由血管生成素(angiogenin，ANG)在成熟tRNA反密码子环处特异性切割产生的非编码小RNA，长度约为30-35nt，分为5′-tiRNA和3′-tiRNA，可类似miRNA行使RNA干扰功能，在转录后水平发挥调控作用。研究显示，tiRNA与多种人类疾病有关，例如淋巴瘤，乳腺癌，前列腺癌，慢性病毒性肝炎，其组成和表达水平具有细胞特异性和疾病特异性，在疾病诊断中具有广阔的生物学前景。但由于miRNA和tiRNA序列比较短，如何准确且特异的对这些小分子进行定量，变得尤为重要。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供肿瘤微环境中小分子RNA的准确定量方法。具体涉及一种在肿瘤乳酸微环境中表达的非编码小RNA分子谱及其应用。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供肿瘤微环境中小分子RNA的准确定量方法。具体涉及一种在肿瘤乳酸微环境中表达的非编码小RNA分子谱。

本发明建立并优化了小分子RNA的荧光定量PCR检测方法，下面结合前期细胞及临床样品检测情况对本发明做进一步详细说明，具体实施如下。

弥漫大B细胞淋巴瘤，前列腺癌等实体瘤组织中均存在酸性环境，乳酸能够促进肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的侵袭。本发明采用外源乳酸添加来模拟体内酸性微环境，分别处理不同EBV阳性和阴性B淋巴瘤细胞系，通过深度测序及定量PCR验证，筛选出5种乳酸响应miRNA分子和1种5’-tiRNA分子，这组小分子RNA的表达水平随乳酸浓度的升高有一致稳定的变化趋势，用于预测乳酸微环境相关淋巴瘤等肿瘤疾病恶性程度的诊断和治疗应用上有一定的临床价值。

更具体的，本发明提供了一种定量小分子RNA的方法，该方法包括以下步骤：