[发明专利]狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立

说明书

本发明公开了狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本发明中的一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆，是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的反向遗传操作系统，是由含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达HBF‑1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。通过本发明的反向遗传操作系统拯救获得的重组病毒rHBF‑1与亲本病毒wtHBF‑1相比具有相似的生长特性，且大小、形态与典型的犬瘟热病毒的一致。本发明的提出为狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的拯救以及深入探索犬瘟热病毒的致病致弱分子机制提供了基础和技术手段。

技术领域

本发明涉及一种病毒的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立，特别涉及一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本发明属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)的自然感染宿主不断增多，对世界范围内的多种陆生和水生食肉动物都存在生命威胁。CDV对不同易感宿主致病性不同，可引起不同程度的全身性疾病，致死率也有不同。其中，家猫发病死亡率为0％，家养犬为50％，雪貂达到100％。犬瘟热对毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成了巨大经济损失。目前，我国人均拥有的宠物犬猫数量逐年增多，犬瘟热对人类公共卫生的影响已不容忽视。而且，已经证实CDV融合蛋白和血凝素蛋白在Paget's疾病中促进破骨细胞的形成，人类可能成为CDV的新宿主。

CDV为副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，是单股负链、不分节段RNA病毒。根据血凝素(H)基因的遗传多样性，CDV被划分为7个基因型，但只有1个血清型。CDV基因组从3’端到5’端依次为：3’端非编码区(3’UTR)、核基因(N)、磷基因(P)(内部含有两个非结构蛋白基因C和V)、基质基因(M)、融合基因(F)、血凝素基因(H)、大聚合酶基因(L)和5’端非编码区(5’UTR)。CDV基因组RNA在核蛋白N的包裹下，聚合酶蛋白(L)及其辅助因子磷蛋白(P)共同作用，形成核衣壳(RNP)，这是CDV最小感染单位，遵循“6碱基原则”的顺序合成加帽和启动病毒转录与翻译，产生子代病毒。

由于RNA病毒的基因组难以在体外任意操作，反向遗传技术的发明，为体外改造病毒RNA基因组提供了强有力的工具。目前，国内外学者建立了多个CDV反向遗传系统，但主要针对CDV弱毒疫苗株。CDV弱毒疫苗株与CDV强毒株在核苷酸序列上存在较大差异，并且，弱毒疫苗株一般不引起动物发病和死亡，不适合用于阐述犬瘟热病毒的致病机理。此外，CDV强毒虽然能导致动物发病和死亡，但体外分离和培养较为困难。CDV强毒无法感染野生型Vero细胞，只能感染表达信号淋巴细胞活化分子(Signaling lymphocyte activationmolecule,SLAM)的稳定细胞系，从而实现体外大量增殖。随着CDV强毒对细胞的适应和传代次数增加，可能会导致CDV强毒毒力和致病性下降。CDV强毒的这些特性，极大地限制了其反向遗传系统的建立，及CDV强毒相关重组病毒的拯救和增殖。因此，本发明构建了狐源犬瘟热病毒强毒株HBF-1的反向遗传系统。犬瘟热病毒强毒株HBF-1为从北极狐病料样品中分离的一株强毒(犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究，高晗等，中国预防兽医学报，2012年12月，第32卷，第12期)。为了区别野生型CDV病毒wtHBF-1株，我们在pcDNA3.2-HBF-1中人为添加了遗传标记位点。比较了重组病毒rHBF-1与wtHBF-1的体外生长特性。数据结果显示：本研究利用构建的狐源CDV强毒HBF-1反向遗传系统，成功拯救获得重组病毒rHBF-1，rHBF-1具有与野生型wtHBF-1相似的生长特性。本发明的提出为未来深入研究CDV的致病机理和发病机制、致病性和新型疫苗提供了强有力的平台和工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；