[发明专利]狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立

权利要求书

1.狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，其特征在于，所述的感染性cDNA克隆是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种获得权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取HBF-1病毒悬液的总RNA；

(2)对获得的RNA进行反转录，获得cDNA。

(3)利用四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收；

F1 5’-GCGGCCGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAGACAAAGTTGGCTAAG-3’

R1 5’-GCGTACGTGAAAGCAGTTTTGAGCCT-3’

F2 5’-CTGCTTTCACGTACGCTTAAAAGCAATTATAAAAAACTTAGG-3’

R2 5’-GTTTAAACGCTTTTGAAGGAAATTAGGCGGGACT-3’

F3 5’-TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG-3’

R3 5’-GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA-3’

F4 5’-GGGATGATGACCGTGTTAATTAATCCCTTACCGATGATTGAATT-3’R4 5’-CGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAGACAAAGCTGGGTATGATAAC-3’

(4)真核表达载体pcDNA3.1的改造

对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2；

(5)将F1、F2、F3、F4片段分别连接至pEASY-Blunt，测序，将测序正确的各基因片段分别依次连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的质粒。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)获得的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，步骤(4)中带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆在拯救重组狐源犬瘟热病毒强毒rHBF-1株中的应用。

5.一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，其特征在于，所述的操作系统由含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。

6.如权利要求5所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，其特征在于，编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别如SEQID NO.4-6所示。