[发明专利]一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为蛋白A的结构域串联体、蛋白G的结构域串联体、蛋白L的结构域串联体进行组合，所述组合为AG、AL、GL或AGL；所述串联体为2个重复的蛋白结构域；所述AG的序列如SEQ NO:10所示；所述AL的序列如SEQ NO:11所示；所述GL的序列如SEQ NO:12所示；所述AGL的序列如SEQ NO:13所示。

2.如权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述蛋白A的结构域为蛋白A的B结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N6G、N23T、G29A和N52K；所述蛋白A的B结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；

所述蛋白G的结构域为蛋白G的C2结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N7T、N34K、N36A和W42K；所述蛋白G的C2结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO: 5所示；

所述蛋白L的结构域为蛋白L的B3结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N17K、Q26A、A35E、A57V、L59V、G62K、N67T和R69K；所述蛋白L的B3结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO: 9所示。

3.如权利要求2所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述蛋白A、蛋白G、蛋白L均通过基因定点突变，提高了耐碱稳定性；通过基因定点突变，提高了蛋白A变异体对IgG3亚型的吸附能力，相应地其组合蛋白AG、AL、AGL对IgG3亚型的吸附能力也增强。

4.一种如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将蛋白A的B结构域串联体、蛋白G的C2结构域串联体和蛋白L的B3结构域串联体进行组合，构建基因重组质粒和表达菌株；

（2）重组免疫球蛋白结合蛋白的表达和纯化及吸附性能评价；

所述蛋白A的B结构域的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；所述蛋白G的C2结构域的氨基酸序列如SEQ NO:5所示；所述蛋白L的B3结构域的氨基酸序列如SEQ NO:9所示；所述重组质粒包含能编码如SEQ NO:10~13所示的氨基酸序列的基因。

5.一种如权利要求1~3任一项 所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，具体步骤为第一步层析选用亲和层析，第二步层析选用离子交换层析，第三步层析选用疏水层析；或第一步层析选用疏水层析，第二步层析选用亲和交换层析，第三步层析选用离子交换层析。

6.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括不同的层析步骤之间用超滤膜包置换5倍体积的缓冲液，将终蛋白溶液置换于生理盐水中，所述超滤膜包的孔径为5K。

7.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析使用的平衡液为10-50mM bis-tris，洗脱液为180mM 咪唑的bis-tris；所述离子交换层析使用的平衡液为含有0.05-2wt% TritonX-100的10-50mM bis-tris ，冲洗液为10-50mM bis-tris，洗脱液为含有150mM NaCl的bis-tris；所述疏水交换层析使用的平衡液为含有1.5M（NH₄）₂SO₄的PBS，洗脱液为PBS，所述平衡液、冲洗液、洗脱液的pH值均为7.2。

8.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析使用的填料为phenyl sepharose FF、Phenyl bestarose FF、Phenyl bestarose HP或其它性质相同的填料；所述亲和层析使用的填料为TALON superflow、Ni sepharose 6FF、NiBestarose FF或其它性质相同的填料；所述离子交换层析使用的填料为DEAE sepharoseFF、capto DEAE或其它性质相同的填料。