[发明专利]高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法

说明书

本发明提供一种高活性β‑半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者SEQ ID NO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸的衍生氨基酸序列；编码该高活性β‑半乳糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或者SEQ ID NO：1所示序列经消除、取代、添加一个或多个碱基且能够编码相同功能β‑半乳糖苷酶的基因序列。本发明SEQ ID NO：2所示氨基酸序列及衍生氨基酸序列的β‑半乳糖苷酶具有高的酶活性，同时采用本发明的包含SEQ ID NO：1和panARS基因的游离型质粒可用于β‑半乳糖苷酶工程菌高通量筛选；通过高通量筛选能够快速获得工程菌，缩短菌株培养周期。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及β-半乳糖苷酶，以及涉及用于高通量筛选具有β-半乳糖苷酶活性的游离型质粒，和该质粒的制备方法。

背景技术

乳糖酶(lactase)，又称作β-半乳糖苷酶，能够催化β—半乳糖苷化合物中β—半乳糖苷键发生水解，将人体内过多的乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，解决乳糖不耐受患者食用乳制品的问题。再者，乳糖酶还可在人体内通过转糖苷作用生成低聚糖，这些低聚糖是一种低分子量、不粘稠的水溶性膳食纤维，可大大减少肠道有害毒素的产生，对预防便秘和腹泻有很重要的作用。

绝大多数用于重组蛋白表达的载体都是整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，整合型表达的优势主要表现为稳定性好，但缺点也十分明显，如相对较低的转化效率、蛋白质生产的一定程度的异质性、非特异性整合和胁迫条件下多拷贝整合的遗传不稳定性。游离型表达具有更简单的方案和更高的转化效率。游离型质粒转化毕赤酵母可以使目的基因的拷贝数显著增加，此外对菌体基因组的影响相对较小，对菌体本身的生长和代谢造成不利影响的几率较低。

随着高通量工作的不断发展，已经挖掘出可用于穿梭质粒的自主复制序列(ARS)。ARS首次被发现是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，被确定可以作为游离质粒能够自主复制的基因组序列。基因组ARS序列，被认为是起源于有丝分裂期间的DNA复制。已经发现在巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母基因组上，功能上与ARS序列相似的序列(PARS和panARS)。含有这种自主复制序列的环状质粒都可以高效转化到酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母中。迄今为止，毕赤酵母采用游离型质粒表达异源蛋白的报导非常少见，因此开发能够在毕赤酵母中稳定高效表达的游离型质粒具有重要意义。

易错PCR技术构建随机突变文库，是定向进化研究最早采用的一种方式。易错PCR技术主要通过增加PCR体系中Mg²⁺浓度、添加Mn²⁺采用低保真性的Taq酶和调整4种dNTP的含量等方式引入随机突变。该技术最早是由Leung等人提出，其关键步骤在于控制突变频率，突变频率太高或太低都无法获得令人满意的突变库，此外一般情况下，仅一轮易错的突变筛选往往不能获得满意的结果，需进行连续易错PCR加高通量筛选。

建立一种高通量筛选的方法是快速获得可应用于工业生产的重组工程菌的关键。高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以96孔板、微板或芯片形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的实验仪器检测实验数据，从而在短时间内对数以千、万计的样品进行测试。要实现高通量筛选，则需要将传统的菌种培养转变为微型化培养，采用特定的底物显色反应平板初筛或者流式细胞技术等加快筛选效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供高酶活的β-半乳糖苷酶。

本发明的另一目的是提供用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒。

本发明的再一目的是提供上述游离型质粒的制备方法。