[发明专利]高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法

权利要求书

1.高活性β-半乳糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者SEQ IDNO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸且具备与SEQ ID NO：2代表的β-半乳糖苷酶相同功能的衍生氨基酸序列。

2.用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒，其特征在于，包含如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3所示的序列。

3.用于表达高活性β-半乳糖苷酶的宿主细胞，其特征在于，包含如SEQ ID NO：1和SEQID NO：3所示的序列。

4.用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含有自主复制序列的游离型质粒

合成panARS基因序列，即SEQ ID NO：3所示序列，将其克隆到puc57克隆载体上；酶切puc57-ARS和pGAPzαA，连接载体和目的基因panARS；转化连接产物到top10感受态中，用菌落PCR和酶切进行筛选验证；验证正确的克隆进行测序验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA；

(2)构建β-半乳糖苷酶重组表达载体

将构建的parsGAPzαA和lac0基因的pPIC9K-lac0双酶切，连接载体和lac0基因，转化top10；用菌落PCR和双酶切验证的方法进行筛选验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA-lac0；其中lac0基因的序列如SEQ ID NO：1所示；

(3)构建β-半乳糖苷酶毕赤酵母表达菌的随机突变文库

以parsGAPzαA-lac0为模板，做易错PCR扩增lac0基因的上游、中游和下游三段序列，回收易错PCR产物；再以易错PCR的三段产物为大引物，以parsGAPzαA-lac0为模板做MegaWhopPCR扩增全长质粒，得到的产物经DpnI酶消化原始质粒模板，纯化后直接转化大肠杆菌；挑取若干个克隆子送测序，检测突变率，保证碱基突变个数在1-3之间；待所有条件全部符合后，混合菌液提取突变体质粒，电转化毕赤酵母X33、GS115、SMD1168和KM71；

(5)高通量筛选具有β-半乳糖苷酶活性的重组菌

转化后的菌液涂布到含有zeocin和1‰X-gal的YPD平板；28℃培养2-3天；观察平板显色情况；挑取显色深的菌落进入深孔板培养发酵，最终通过酶活检测筛选出酶活较高的重组菌株；筛选得到的具有高酶活的潜力菌株。

5.根据权利要求4所述的用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中做易错PCR扩增lac基因的上游、中游和下游三段序列时所用的引物对应分别为GAP_EpF和seqLa_R1、seqLa_F2和seqLa_R2、seqLa_F3和GAP_EpR，其序列为GAP_EpF序列如SEQ ID NO：15所示，seqLa_R1序列如SEQ ID NO：9所示，seqLa_F2序列如SEQID NO：10所示，seqLa_R2序列如SEQ ID NO：11所示，seqLa_F3序列如SEQ ID NO：12所示，GAP_EpR序列如SEQ ID NO：16所示。