[发明专利]用于检测哈维弧菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测哈维弧菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分哈维弧菌与其它种属的菌种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测哈维弧菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对哈 维弧菌进行TaqMan探针定量检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

哈维弧菌(Vibrio harveyi)，属弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)。 广泛分布于海洋环境中，它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致 病菌。哈维弧菌既是印尼、泰国、印度、澳大利亚、厄瓜多尔及中国等国家和 地区养殖对虾的重要致病菌，又是许多养殖鱼类的致病菌。

哈维弧菌为革兰氏阴性，发光的海洋细菌，短杆状，菌体直或稍弯曲，两 端钝圆，无荚膜，不形成芽孢，极端单鞭毛能运动，单个存在，很少出现两个 或链状排列，大小为0.5～0.9μm×1.1～1.9μm。无盐培养基中不生长，在含盐营 养琼脂平板上生长良好，28℃培养24h菌落圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、闪 光，在TCBS平板上呈黄色菌落，4℃以下和40℃以上不能生长。

哈维弧菌的胞外产物(ECP)具有致病性，其分泌的胞外蛋白酶、脂多糖、 磷脂酶或溶血素对虾类和鱼类的致病性起重要作用，并损伤宿主组织器官等。 易感性较强的虾类有中国对虾、南美白对虾幼体、长毛对虾及日本对虾成虾等， 鱼类有鲈鱼、石斑鱼、鲻鱼、虹鳟鱼、大黄鱼、大菱鲆等。

感染哈维弧菌后，目前没有有效的方法进行治疗，只能通过加强疫病监测 与检疫，达到防控该病爆发的概率。国内外学者通过大量的研究，建立了一系 列针对哈维弧菌的检测方法，如组织病理解剖法、电镜观察法、雷氏液体巯基 乙酸盐培养法、PCR检测法及LAMP法。但是前三类方法操作复杂、耗时长及 检测灵敏度低，只能对发病明显的对虾进行诊断；PCR检测法虽然结果准确， 但检测时间长、操作复杂、无法定量，很难在生产用进行推广应用；LAMP法 虽然检测时间快但假阳性高，达不到精确检测的要求。

本发明提供了一种能够定量、快速、实时监测哈维弧菌的方法，以克服现

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测哈维弧菌的TaqMan探针定量 检测方法，所述方法能够定量、快速、实时检测哈维弧菌，使哈维弧菌的 检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用TaqMan探针定量检测哈维弧菌特异性基因ToxR基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述哈维弧菌特异性基因ToxR基因的Ct值小于35 时，哈维弧菌的检测结果为阳性；当所述哈维弧菌特异性基因ToxR基因的Ct 值大于35时，哈维弧菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计ToxR基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述哈维弧菌特异性基因ToxR基因的检测引物如 SEQID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-AGAGCCCACTGCTGAGACAAA-3')；

SEQ ID NO:2(5'-CAGGTGCAGATTTTAATGGTTGAG-3')。

探针序列如SEQ ID NO:3所示；