[发明专利]甲基化测序DNA文库的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种甲基化测序DNA文库的构建方法，包括：a)使用一端带接头的随机引物和/或半随机引物扩增重亚硫酸盐处理后的单链DNA，得到同时具有所述接头和所述单链DNA互补链的中间体DNA；其中所述接头具有由衔接物连接在一起的两段测序接头序列，且所述衔接物具有AP位点；b)用单链DNA环化连接酶将所述中间体DNA的两端连接得到环化DNA；以及c)使用APE酶切割所述环化DNA中的AP位点以去环化。该方法构建的文库多样性好，且基本不影响后续的测序过程。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种甲基化测序DNA文库的构建方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶(5’mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态，如管家基因；去甲基化状态，如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态，如女性的一条失活的X染色体。

最近研究表明，DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素，包括抑癌基因或MMR基因的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄生序列(endoparasiticsequence)的激活，最终也导致肿瘤发生。例如，hMLH1是重要的错配修复基因，MLH1启动子甲基化导致的表达缺失可能致使微卫星不稳定(MSI)，与散发性结直肠癌的发生、发展相关。所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。

目前DNA甲基化检测技术包括焦磷酸测序法(Pyrosequencing)、定量甲基化位点特异性PCR法(Methylight、MS-HRM)等。二者均采用甲基化微点特异的引物扩增目的CpG，然后经过焦磷酸测序或荧光定量PCR方法检测目的位点。二者只能完成单一位点检测，效率低，通量低。DNA甲基化的功能单位不是单个CpG，而是整个基因启动子区域或染色体，乃至基因组水平的甲基化模式发生变化。因此焦磷酸测序法(Pyrosequencing)、定量甲基化位点特异性PCR法等低通量的甲基化检测技术已无法满足当前表观遗传学研究的要求。

发明内容

无论是焦磷酸测序法(Pyrosequencing)还是定量甲基化位点特异性PCR法(Methylight、MS-HRM)等均存在效率低，通量低等缺点。本发明提供一种新颖的甲基化DNA文库的构建方法，可以通过配合高通量测序全面地高效地检测基因组范围内的甲基化模式。

具体的，本发明涉及一种甲基化测序DNA文库的构建方法，包括：

a)使用一端带接头的随机引物和/或半随机引物扩增重亚硫酸盐处理后的单链DNA，得到同时具有所述接头和所述单链DNA互补链的中间体DNA；

其中所述接头具有由衔接物连接在一起的两段测序接头序列，且所述衔接物具有AP位点；

b)用单链DNA环化连接酶将所述中间体DNA的两端连接得到环化DNA；以及

c)使用APE酶切割所述环化DNA中的AP位点以去环化。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用PCR扩增合成方法使单链DNA接上5’接头，并利用ssDNA环化连接酶使单链DNA的3’端接上接头，APE酶水解AP位点，即形成带双端接头的DNA文库。该方法构建的文库多样性好，且基本不影响后续的测序过程。