[发明专利]甲基化测序DNA文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.甲基化测序DNA文库的构建方法，包括：

a)使用一端带接头的随机引物和/或半随机引物扩增重亚硫酸盐处理后的单链DNA，得到同时具有所述接头和所述单链DNA互补链的中间体DNA；

其中所述接头具有由衔接物连接在一起的两段测序接头序列，且所述衔接物具有AP位点；

b)用单链DNA环化连接酶将所述中间体DNA的两端连接得到环化DNA；以及

c)使用APE酶切割所述环化DNA中的AP位点以去环化。

2.根据权利要求1所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，步骤c)后还包括，在酶切后的DNA的至少一段添加标签序列。

3.根据权利要求1所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述半随机引物中G碱基的含量低于25％；优选不含G碱基和/或仅含有一个G碱基。

4.根据权利要求3所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述半随机引物的序列为HHHHHHHH和/或HHHHGHHH，且H＝A/C/T。

5.根据权利要求1所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述衔接物完全由AP位点构成。

6.根据权利要求1～5任一项所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述单链DNA由基因组DNA及任选的外源DNA片段化得到，所述基因组DNA及所述外源DNA独立地选自植物或动物DNA。

7.根据权利要求6所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述基因组DNA为动物DNA，且其来源为血液、血浆、细胞培养上清、脑脊液、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或细胞裂解物、骨骼或毛发。

8.根据权利要求7所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述片段化的方法为超声随机打断。

9.根据权利要求7所述的甲基化测序DNA文库的构建方法，所述外源DNA为没有甲基化修饰的λDNA。

10.试剂盒，其包括权利要求1～9任一项中所定义的：带接头的随机引物和/或半随机引物、测序接头序列、APE酶以及单链DNA环化连接酶。

11.权利要求1～9任一项所述方法或权利要求10所述的试剂盒在甲基化测序中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其中甲基化测序为是第二代测序。