[发明专利]一种基于衍生化的母乳寡糖表征和定量分析方法

说明书

本发明涉及一种基于衍生化的母乳中寡糖的分离表征和定量分析方法。其特征是：样品经过低温离心除脂质，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，使用含有荧光/紫外发色基团的氨基试剂对寡糖进行还原胺化反应并通过快速萃取除去其中大过量试剂，获得的标签化的寡糖经色谱分离，液相或质谱检测，对于母乳中寡糖进行定性分析和定量测定。该方法具有定性全面，定量准确，灵敏度高，重现性好且不依赖于质谱。适用于哺乳动物母乳寡糖的全面、快速的定性和/或定量分析。

技术领域

本发明涉及一种基于衍生化的母乳中寡糖表征和定量的分析方法。其特征是：将母乳样品前处理后进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现母乳寡糖在线分离分析。该方法具有灵活全面，选择性佳，稳定性好，操作可控，时间较短等特点，适用于哺乳动物乳全面、快速的定量和/或定性分析。

技术背景

母乳作为新生儿(崽)的不可替代的天然营养来源，这种个性化的营养摄入不仅为婴幼儿(崽)提供的必需的生长物质，也在支持其建立健康的肠道菌群，增强免疫力，促进神经系统功能完善方面发挥着重要作用。母乳中含有多种成分，例如蛋白质，脂质，碳水化合物，所有这些成分都有助于婴儿的健康成长和发育，但大多数的营养物质，如脂肪和乳糖，其含量都会随着泌乳期发展而增加，而特定的保护成分(如寡糖和免疫活性蛋白)则在泌乳开始时就显示出最大浓度。随着碳水化合物质谱和寡糖生物功能研究技术的发展，人们对与母乳寡糖的研究逐渐深入。

母乳寡糖的详细分析对于了解其在胃肠道微生物群发育和防御病毒感染中的作用非常重要。但是，由于种种原因，母乳寡糖全面系统的分析检测十分困难，定量分析难度更大。母乳寡糖结构复杂，异构体很多，并且无紫外吸光基团；实际的母乳样品中，中性母乳寡糖与唾液酸化母乳寡糖的丰富差异在十倍以上，这些因素都严重影响了母乳寡糖的分离和检测。

我们开发了一种适合于母乳样品中衍生化寡糖分析的在线一维和/或二维亲水分离方法。方法利用固定相与寡糖间的亲水-电荷相互作用，在合适的液相流动相体系下，可以实现中性寡糖和唾液酸化寡糖的分别的同步的分离检测，选用紫外检测器和荧光检测器同步进行数据采集，串联质谱检测器可以获得更多的寡糖信息。

发明内容

本发明涉及一种基于衍生化的母乳中寡糖的分离表征和定量分析方法。其特征是：样品经过前处理后使用含有荧光/紫外发色基团的氨基试剂对寡糖进行还原胺化，获得的标签化的寡糖经亲水色谱分离，液相或质谱检测，对于母乳中寡糖进行定性分析和定量测定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于衍生化的母乳中寡糖的分离表征和定量分析方法，将母乳样品经过前处理，用氨基试剂对寡糖进行还原胺化衍生，再经亲水作用色谱分离分析，获得样品中寡糖的种类和含量信息。流动相为有机溶剂和水或有机溶剂和缓冲盐水溶液，通过优化色谱参数，使用等度或梯度洗脱条件。

1.所述前处理步骤为：取一定体积均质母乳样品，0-10℃,50g-50000g离心不少于3分钟，取出下层溶液后加入加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃，500-50000g离心不少于3分钟,取出上次清液，离心1-5次后蒸干，得到母乳寡糖提取除脂除蛋白样品；

2.衍生化过程包括：将前处理后的母乳寡糖样品中加入衍生化试剂、还原剂、反应溶剂和冰醋酸溶液，在25-100℃的条件下反应15min-5h，反应结束后，于-20℃-4℃终止反应；衍生化试剂为邻/间/对氨基苯甲酰胺，邻/间/对氨基苯甲酸，氨基吖啶酮中的一种或几种；还原剂为氰基硼氢化钠，硼氢化钠中的一种或两种；反应溶剂为DMSO，DMF，甲醇，乙醇，乙腈中的一种或几种；

3.萃取过程包括：步骤(1)所述的萃取除大过量衍生化试剂的过程为：将反应完成后的溶液加入0.5-5倍体积量的纯水，再次干燥，干燥后加入固定体积纯水定容，再加入3-10倍体积量的戊醛，己醛，庚醛，辛醛，壬醛中的一种或几种，漩涡震荡萃取3-120秒，敞口静置不少于5秒后分层，取下层水层以备分析。