[发明专利]一种基于衍生化的母乳寡糖表征和定量分析方法

权利要求书

1.一种基于衍生化的母乳寡糖表征和定量分析方法，其特征在于，具体的过程为下述第一种或第二种或第三种或三种方式中的任二种或三种的结合：

第一种方式：

（1）将母乳样品和寡糖标准品溶液分别进行前处理，然后用试剂对母乳或寡糖标准品中游离寡糖进行分别还原胺化反应，衍生反应后通过萃取除去大过量衍生化试剂；

（2）采用亲水作用色谱HILIC对步骤（1）中衍生化的寡糖进行分离分析，选择紫外检测器和荧光检测器进行检测；

（3）在步骤（2）选定的检测系统中，使用经过步骤（1）衍生和步骤（2）分析的寡糖标准品对母乳中寡糖进行定性确认和定量分析；

第二种方式：

（1）将含有内标母乳样品进行前处理，然后用试剂对母乳中游离寡糖进行还原胺化反应，衍生反应后通过萃取除去大过量衍生化试剂

（2）采用亲水作用色谱HILIC对步骤（1）中衍生化的寡糖进行分离分析，选择质谱检测进行定性，同时采用紫外检测器和荧光检测器进行检测；

（3）将母乳样品依照步骤（1）获得至少6个浓度水平的内标定量检测溶液，进行步骤（2）分离分析，记录色谱图和峰面积，以峰面积Y和质量X进行线性回归计算，得到衍生化母乳样品的线性回归方程或标准曲线，得到母乳样品中寡糖的绝对含量信息；

第三种方式：

（1）将母乳样品进行前处理，然后用试剂对母乳中游离寡糖进行还原胺化反应，衍生反应后通过萃取除去大过量衍生化试剂

（2）采用亲水作用色谱HILIC对步骤（1）中衍生化的寡糖进行分离分析，选择质谱检测进行定性，同时采用紫外检测器和荧光检测器进行检测；

（3）在步骤（2）选定的检测系统中，使用质谱对寡糖进行定性确认；

步骤（1）中萃取除去大过量衍生化试剂的过程为：将反应完成后的溶液加入0.5-5倍体积量的纯水，再次干燥，干燥后加入固定体积纯水定容，再加入3-10倍体积量的戊醛，己醛，庚醛，辛醛，壬醛中的一种或几种，漩涡震荡萃取3-120秒，敞口静置不少于5秒后分层，取下层水层以备分析；

三种方式的亲水作用色谱HILIC对步骤（1）中衍生化的寡糖进行分离分析过程为：样品经自动进样器吸样后进入色谱柱1，此时色谱柱1与色谱柱2经阀实现串联，在流动相作用下，样品中仅衍生化酸性寡糖进入色谱柱2，待全部衍生化酸性寡糖进入色谱柱2且乳糖和其他中性寡糖仍保留在色谱1中时，操作切换阀，使分析过程变为两色谱柱并联，实现两色谱柱中酸性寡糖和中性寡糖的同时、联立的分析和检测；

采用HILIC方法实现衍生化寡糖分离中使用的色谱柱1，其填料为硅胶表面键合极性基团使其同时具有极性和负电性，键合的极性基团为下述中的一种或几种：谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，含有前述四种氨基酸中任意两种的二肽，含有前述四种氨基酸中任意三种的三肽，或含有前述四种氨基酸的四肽；基团键合量0.3-2mmol/g，硅胶粒径5-100mm, 孔径分布50-100埃，比表面积50-10000m²/g；使用水和有机溶剂作为流动相，流动相 A 为有机溶剂，B 为水，使用梯度方法进行洗脱，检测；流动相中的有机溶剂为甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或几种，梯度洗脱过程为：0-10min，洗脱液80%A/20%B，10-30min，洗脱液80%A/20%B-40%A/60%B，30-30.1min，洗脱液40%A/60%B-80%A/20%B，30.1-45min，洗脱液80% A/20%B；

采用HILIC方法实现寡糖分离中使用的色谱柱2，色谱柱中填充硅胶或硅胶表面键合极性基团的填料，所键合的极性基团有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖基中的一种或几种；使用水、缓冲盐水溶液和有机溶剂作为流动相，流动相 A 为有机溶剂，B 为水，C 为缓冲盐水溶液；使用梯度方法进行洗脱，检测；流动相中的有机溶剂为甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或几种，梯度洗脱过程为：0-6min，洗脱液80%A/10%B/10%C；6-36min，洗脱液80%A/10%B/10%C-55%A/35%B/10%C；36-38min，洗脱液55%A/35%B/10%C；38-38.1min，洗脱液55%A/35%B/10%C-80%A/10%B/10%C；38-47min，洗脱液80%A/10%B/10%C；

所选择缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH 如下:

a)甲酸铵缓冲盐，浓度2-200 mM，pH 2-7；或

b)乙酸铵缓冲盐，浓度2-200 mM，pH 2-7；或

c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度2-200 mM，pH 6-10；

寡糖标准品包括：

前处理步骤为：

取常温下均质母乳样品于离心管中，0-10℃, 50g-50000g离心不少于3分钟，取下层溶液完成脂质的去除；除质后母乳样品，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃，500-50000g离心不少于3分钟,取出上次清液，离心1-5次后蒸干，得到母乳寡糖提取除脂除蛋白样品；其中，有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种；

衍生化过程包括：

将前处理后的母乳寡糖样品中加入衍生化试剂、还原剂、反应溶剂和冰醋酸，在25-100℃的条件下反应15min-5h，反应结束后，于-20℃-4℃终止反应；衍生化试剂为邻/间/对氨基苯甲酰胺，邻/间/对氨基苯甲酸，氨基吖啶酮中的一种或几种；还原剂为氰基硼氢化钠，硼氢化钠中的一种或两种；反应溶剂为DMSO，DMF，甲醇，乙醇，乙腈中的一种或几种；

按照均质母乳体积100-200mL计，前处理后，加入以反应溶剂配制的100-200mL的含0.35-1mol/L衍生化试剂和1-2mol/L还原剂的反应液，反应液中反应溶剂：冰醋酸V/V=50:50-90:10；

步骤（1）所述的母乳样品包括人乳和其他哺乳动物母乳中的一种或几种。