[发明专利]老年性痴呆小鼠模型的制备方法

权利要求书

1.一种老年性痴呆小鼠模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、AD患者脑内提取的病理性tau，即AD p-tau的分离：

10 %的AD脑匀浆液，在4℃下，27000 xg离心30 min，取上清，在4℃下， 235000 xg离心45 min，取沉淀Oligo-tau用生理盐水洗三次，用生理盐水重悬，-80℃保存，得到的tau为ADO-tau；AD O-tau经盐析、尿素处理，透析、离子交换层析，收集磷酸化的fractions，透析，-80℃保存，得到的tau为AD P-tau；

步骤2、海马注射AD P-tau：四月龄的C57BL/6小鼠，腹腔注射2.5%的 2-Avertin 麻醉，根据小鼠脑图谱，使用脑立体定位仪、微量注射泵和 31-gauge Hamilton 微量注射器，海马注射AD P-tau，注射的AD P-tau中蛋白浓度11mg/ml，tau的量600ng/2.5ul；

步骤3、小鼠4月龄时脑注射后，采用常规的饲养方式自由摄取水和食物，室温20℃，12小时光照/黑暗循环环境；

步骤4、组织固定与切片：取小鼠，先经腹腔注射2.5%的 2-Avertin 麻醉剂，麻醉后，开胸暴露心脏，自心尖部将灌注针头经左心室插至升主动脉，灌注生理盐水后，改灌注含有4%多聚甲醛的0.1 MPBS，待动物全身抽搐后，调慢灌注速度至50滴/min，持续时间30 min后，取出大脑放入含有4%多聚甲醛的0.1 MPBS中后固定4 h，再先后转入含20%和30%蔗糖溶液中，待组织块下沉后，行冠状位冰冻连续切片，片厚40 μm，漂于0.01 M PBS中；

步骤5、免疫组织化学，

501、挑取海马结构清晰的漂片，置于0.01 M PBS缓冲液中漂洗3遍后，放入含有10%triton-100液体中20min，0.01 M PBS缓冲液中漂洗3遍，放入含有10%山羊血清的封闭液中，在室温下振摇2 h；

502、将封闭好的切片转入到1:1000稀释的对磷酸化tau的特异性抗体mouse-AT8 中，室温下轻轻振摇1 h后放入4℃冰箱中过夜；

503、次日晨吸去一抗，用PBS清洗3遍后，加入Alexa-555荧光标记的抗小鼠二抗，室温下轻轻振摇2 h，加入1:5000 Hochest孵育15 min；

504、0.01M PBS（pH 7.2）避光清洗3次，每次10min；

505、荧光封片液封片后激光共聚焦显微镜下观察。

2.根据权利要求1所述的老年性痴呆小鼠模型的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，注射的坐标如下：前囟向后2.5 mm，向左/右旁开2.0 mm，自硬膜向腹侧进针1.67 mm，注射体积2.5μl，注射速度1.25μl/min，注射后，留针3 min 以防液体外溢。