[发明专利]用于改变基因序列的组合物及方法

说明书

本发明提供了一种用于改变基因序列的组合物，及改变基因序列的方法，还提供了利用所述方法制得的基因序列改变了的细胞及所述细胞的用途。

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地涉及一种用于改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的组合物，还涉及改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的方法，还提供了基因改变了的，特别是TCR与B2M两种基因改变了的细胞及其用途。

背景技术

近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸内切酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。

CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的向导RNA(guide RNA，gRNA)引导定位到基因组的目标序列上，此目标序列必须与一个以NGG或NAG形式的PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列相邻。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生双链断裂，从而激活机体的NHEJ(非同源末端连接，Non-homologousend joining)DNA突变修复机制。在该修复机制下由于没有模板，DNA只是随机修复以恢复其双链结构，这会使修复结果与原基因组序列不同形成突变，导致目标序列的基因在所述细胞中的表达减少或消除。近几年来，已被改造的CRISPR/Cas9系统已经用于真核细胞中的基因组编辑。

目前，已存在基于CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的实例，但仍存在目标基因敲除率低、需要多次转染或转化、操作繁琐、或脱靶率高等问题，尤其对于双基因或多基因的敲除，上述问题更明显。因此，仍需要优化基于CRISPR/Cas9系统的双基因或多基因的敲除方法和更高效率的gRNA组合。

发明内容

本发明提供一种用于改变细胞中基因序列，特别是改变两种基因或多种基因序列，尤其是改变TCR与B2M两种基因序列的组合物，并提供一种改变基因序列，特别是改变两种基因或多种基因序列，尤其是改变TCR与B2M两种基因序列的方法。

本发明第一方面提供了一种改变细胞中基因序列的组合物，所述组合物包含靶向TCR基因的第一gRNA，靶向B2M基因的第二gRNA，以及具有靶向切割活性的核酸内切酶；所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％；

所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自

a.SEQ ID NO:1，

b.SEQ ID NO:2，

c.SEQ ID NO:3，

d.SEQ ID NO:4，

e.SEQ ID NO:5，

f.SEQ ID NO:6，

g.SEQ ID NO:7，

h.SEQ ID NO:8，

i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

所述第二gRNA的引导序列选自

j.SEQ ID NO:9，

k.SEQ ID NO:10，

l.SEQ ID NO:11，

m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

优选地，