[发明专利]用于改变基因序列的组合物及方法

权利要求书

1.一种用于改变细胞中基因序列的组合物，包含靶向TCR基因的第一gRNA，靶向B2M基因的第二gRNA，以及具有靶向切割活性的核酸内切酶；所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％；所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自

a.SEQ ID NO:1，

b.SEQ ID NO:2，

c.SEQ ID NO:3，

d.SEQ ID NO:4，

e.SEQ ID NO:5，

f.SEQ ID NO:6，

g.SEQ ID NO:7，

h.SEQ ID NO:8，

i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

所述第二gRNA的引导序列选自

j.SEQ ID NO:9，

k.SEQ ID NO:10，

l.SEQ ID NO:11，

m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

优选地，

所述第一gRNA的引导序列选自

a.SEQ ID NO:1，

b.SEQ ID NO:2，

或a-b中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

所述第二gRNA的引导选自序列

j.SEQ ID NO:9，

k.SEQ ID NO:10，

或j-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。

2.如权利要求1所述的组合物，其中

所述第一gRNA的引导序列为

SEQ ID NO:1，或

SEQ ID NO:1，其中在SEQ ID NO:1的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；

所述第二gRNA的引导序列为

SEQ ID NO:9，或

SEQ ID NO:9，其中在SEQ ID NO:9的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基，

所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于75％。

3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。

4.如权利要求3所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。

5.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是哺乳动物细胞，优选是灵长类动物细胞，更优选是人细胞。

6.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是免疫效应细胞，优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。