[发明专利]用于治疗血液病症的富集和扩增的人脐带血干细胞

说明书

本发明涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体以及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。所述扩增的人脐带血干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、CD49f+、ALDH+、CD45RA‑并表达多能性基因SOX2、OCT4、NANOG和ZIC3。在一个实施方案中，本发明的所述富集群体中的所述干细胞对于醛脱氢酶活性呈阳性(ALDH+)。另外，在一个实施方案中，所述扩增的干细胞几乎不含T细胞和B细胞并且含有有限数量的单核细胞(CD14)。此外公开了使用本发明的所述干细胞治疗受试者的血液病症的方法和测定化合物对造血干细胞的作用的方法。

本申请是申请号为201480034563.0、申请日为2014年5月16日、发明名称为“用于治疗血液病症的富集和扩增的人脐带血干细胞”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/038361的国家阶段申请，该国际申请分别要求申请日为2013年5月20日，申请号为61/825,354和申请日为2014年4月24日，申请号为61/983,805的美国临时申请的优先权。

发明领域

本发明涉及富集和扩增的人脐带血干细胞、其产生方法，和治疗方法。

发明背景

脐带血(“CB”)造血干细胞(“HSC”)具有使其区别于其成人对应物的众多表型特性和功能特性(Cairo等,“Placental and/or Umbilical Cord Blood:An AlternativeSource of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation,”Blood 90:4665-4678(1997)；Dahlberg等,“Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem andProgenitor Cells,”Blood117:6083-6090(2011)；Delaney等,“Cord Blood GraftEngineering,”Biol.Blood Marrow Transplant 19(1):S74-S78(2013)；Navarrete等,“Cord Blood Banking:A Historical Perspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“Umbilical Cord Blood Transplantation:Pros,Cons andBeyond,”Blood Rev.23:199-204(2009))。CB CD34+细胞由于其广泛的增殖能力、其在体外产生造血集落的能力增加、其产生含有胎儿血红蛋白的红系细胞的能力，和较小数目的这些细胞重新构成清髓的同种异体接受者的能力，而被认为是更原始的(Cairo等,“Placental and/or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source of HematopoieticStem Cells for Transplantation,”Blood 90:4665-4678(1997))。由于单一CB收集物中存在有限数目的干细胞，因此使用CB细胞作为罹患血液恶性肿瘤和遗传病症的同种异体干细胞接受者的HSC移植物已经局限于儿童或较小成人接受者(Cairo等,“Placental and/orUmbilical Cord Blood:An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells forTransplantation,”Blood90:4665-4678(1997)；Navarrete等,“Cord Blood Banking:AHistorical Perspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“Umbilical Cord Blood Transplantation:Pros,Cons and Beyond,”Blood Rev.23:199-204(2009))。这些限制导致在成人接受者中不可接受的高移植失败率和延迟的植入动力学(Cairo等,“Placental and/or Umbilical Cord Blood:An Alternative Source ofHematopoietic Stem Cells for Transplantation,”Blood 90:4665-4678(1997)；Dahlberg等,“Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and ProgenitorCells,”Blood 117:6083-6090(2011)；Delaney等,“Cord Blood Graft Engineering,”Biol.Blood Marrow Transplant 19(1):S74-S78(2013)；Navarrete等,“Cord BloodBanking:A Historical Perspective,”Br.J.Haematol.147:236-245(2009)；Stanevsky等,“Umbilical Cord Blood Transplantation:Pros,Cons and Beyond,”Blood Rev.23:199-204(2009)；Barker等,“Combined Effect of Total Nucleated Cell Dose and HLAMatch on Transplantation Outcome in 1061Cord Blood Recipients withHematologic Malignancies,”Blood 115:1843-1849(2010)；Delaney等,“Strategies toEnhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients,”ExpertRev.Hematol.3:273-283(2010))。克服这些障碍的尝试包括几种不同的策略，例如使用能够促进HSC循环和这些CD34+细胞(2、6-9)的后续分裂的多种细胞因子组合进行两种不同CB移植物的输注或CB CD34+细胞的离体扩增。对于离体干细胞扩增的这些初始尝试已经导致产生较大数目的造血祖细胞和前体细胞，但骨髓重建细胞的数目降低。HSC在很大程度上是在体内缓慢循环的休眠细胞。(Giebel等,“Primitive Human Hematopoietic Cells GiveRise to Differentially Specified Daughter Cells Upon their Initial CellDivision,”Blood 107(5):2146-2152(2006)；Ho等,“The Beauty of Asymmetry:Asymmetric Divisions and Self-Renewal in the Haematopoietic System,”Curr.Opin.Hematol.14(4):330-336(2007)；Huang等,“Symmetry of Initial CellDivisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent ofOntogenic Age and Regulatory Molecules,”Blood 94(8):2595-2604(1999)；Srour等,“Modulation of In vitro Proliferation Kinetics and Primitive HematopoieticPotential of Individual Human CD34+CD38–/lo Cells in G0,”Blood 105(8):3109-3116(2005))。在这些细胞因子组合存在下发生的CB CD34+细胞的快速离体循环和分裂导致HSC定型，其中残余骨髓重建潜能归因于已保持静止或已经历有限数目的细胞分裂的一小部分的干细胞(10-13)。最近，由于希望扩增可移植的CB HSC的数目，已经将间充质细胞饲养层或许多分子如固定化notch配体、铜螯合剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)、全反式视黄酸、芳基烃受体拮抗剂、前列腺素E2(PGE2)或c-MPL激动剂添加至这些细胞因子组合(Dahlberg等,“Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and ProgenitorCells,”Blood 117:6083-6090(2011)；Delaney等,“Strategies to Enhance UmbilicalCord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients,”Expert Rev.Hematol.3:273-283(2010)；Boitano等,“Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote theExpansion of Human Hematopoietic Stem Cells,”Science329:1345-1348(2010)；DeFelice等,“Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Enhances the Cytokine-Induced Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells,”Cancer Res.65:1505-1513(2005)；Himburg等,“Pleiotrophin Regulates the Expansion and Regeneration ofHematopoietic Stem Cells,”Nat.Med.16:475-482(2010)；Milhem等,“Modification ofHematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A,”Blood 103:4102-4110(2004)；Nishino等,“Ex vivo Expansion of Human HematopoieticStem Cells by a Small-Molecule Agonist of c-MPL,”Exp.Hematol.37:1364-1377e1364.(2009)；North等,“Prostaglandin E2 Regulates VertebrateHaematopoietic Stem Cell Homeostasis,”Nature 447:1007-1011(2007))。这些方法中的几种已经在临床试验中进行了评估，但导致产生较大数目的短期而非长期骨髓重建细胞(Dahlberg等,“Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and ProgenitorCells,”Blood 117:6083-6090(2011)；de Lima等,“Transplantation of Ex vivoExpanded Cord Blood Cells Using the Copper Chelator Tetraethylenepentamine:APhase I/II Clinical Trial,”Bone Marrow Transplant 41:771-778(2008)；de Lima等,“Cord-Blood Engraftment with Ex Vivo Mesenchymal-Cell Coculture,”N.Engl.J.Med.367(24):2305-2315(2012)；Delaney等,“Notch-Mediated Expansion ofHuman Cord Blood Progenitor Cells Capable of Rapid Myeloid Reconstitution,”Nat.Med.16(2):232-236(2010))。可选地，也在寻求促进CB CD34+细胞的归巢和植入的效率的策略以增加同种异体CB移植的功效(Goessling等,“Prostaglandin E2 EnhancesHuman Cord Blood Stem Cell Xenotransplants and Shows Long-Term Safety inPreclinical Nonhuman Primate Transplant Models,”Cell Stem Cell 8(4):445-458(2011)；Hoggatt等,“Differential Stem and Progenitor-Cell Trafficking byProstaglandin E2,”Nature 495(7441):365-369(2013)；O'Leary等,“The Role ofDipeptidyl Peptidase 4in Hematopoiesis and Transplantation,”Curr.Opin.Hematol.20(4):314-319(2013))。