[发明专利]猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法

说明书

猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法。是要解决现有猪流行性腹泻病毒纳米灭活疫苗的纳米粒粒径不均一，分散不均匀，免疫力不持久的问题。方法：一、取壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，加入乙酸，配置壳聚糖溶液；配置三聚磷酸钠溶液；二、取猪流行性腹泻病毒系病毒液加入到壳聚糖溶液中，搅拌得混合溶液C；三、将混合溶液C滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌得混合溶液D；四、将混合溶液D离心去上清液，洗涤沉淀，收集固相物E；五、将固相物E加入到去离子水中，真空冷冻干燥，得到猪流行性腹泻病毒/壳聚糖纳米疫苗。疫苗的纳米粒粒径均一，分散均匀，具有缓释效果。本发明应用于纳米疫苗领域。

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的急性、高度传染性的肠道疾病，在市场上预防猪流行性腹泻的主要疫苗是猪流行性腹泻病毒灭活苗、弱毒苗和基因工程疫苗，目前，国内还没有有效的防治猪流行性腹泻的方法，如何提高疫苗的免疫效果是疫苗免疫研究中急需解决的问题。

现有的猪流行性腹泻病毒纳米灭活疫苗由于其纳米粒的粒径不均一，分散不均匀，导致疫苗的免疫效果不稳定。而且现有的猪流行性腹泻病毒疫苗中的病毒多暴露在外，病毒很快释放，疫苗的免疫力不持久。

发明内容

本发明是要解决现有猪流行性腹泻病毒纳米灭活疫苗的纳米粒粒径不均一，分散不均匀，免疫力不持久的问题，提供一种猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法。

本发明猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

一、取壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入乙酸，继续搅拌5-15min配置成浓度为0.5-2.0mg/mL壳聚糖溶液；取三聚磷酸钠配置成浓度为0.75-1.75mg/mL的三聚磷酸钠溶液；

二、取50-400μL猪流行性腹泻病毒系病毒液，加入无菌去离子水补足至2mL，得到病毒液A；将病毒液A加入到过滤除菌后的壳聚糖溶液中，在室温、无菌条件下搅拌5-10min，得到混合溶液C；所述猪流行性腹泻病毒系病毒液中的病毒为猪流行性腹泻病毒SZ株；所述猪流行性腹泻病毒系病毒液的滴度为10⁷TCID 50/mL；

三、将混合溶液C在室温、无菌条件下搅拌均匀，然后滴加过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液，在保持搅拌速度不变的条件下继续搅拌，得到混合溶液D；

四、将混合溶液D于4℃下离心20-30min，去上清液，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3-5遍，收集固相物E；

五、将固相物E加入到4℃的无菌去离子水中，真空冷冻干燥24-26h，得到猪流行性腹泻病毒/壳聚糖纳米疫苗。

所述猪流行性腹泻病毒SZ株由哈药集团生物疫苗有限公司提供。

进一步的，步骤一中乙酸的体积浓度为34％-38％。

进一步的，步骤二中过滤除菌后的壳聚糖溶液是将步骤一制备的壳聚糖溶液在无菌操作台中通过0.22μm的细菌滤器进行过滤得到的。

进一步的，步骤二中病毒液A与过滤除菌后的壳聚糖溶液的体积比为2:(5-6)。

进一步的，步骤二中搅拌速度为300-400r/min。

进一步的，步骤三中搅拌速度为900-1300r/min。

进一步的，步骤三中混合溶液C与过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液的体积比为7:(2-3)。

进一步的，步骤三中过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液是将步骤一制备的三聚磷酸钠溶液在无菌操作台中通过0.22μm的细菌滤器进行过滤得到的。

进一步的，步骤三中第一次搅拌的时间是10-15min。