[发明专利]猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法

权利要求书

1.猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

一、取壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入乙酸，继续搅拌5-15min配置成浓度为0.5-2.0mg/mL壳聚糖溶液；取三聚磷酸钠配置成浓度为0.75-1.75mg/mL的三聚磷酸钠溶液；

二、取50-400μL猪流行性腹泻病毒系病毒液，加入无菌去离子水补足至2mL，得到病毒液A；将病毒液A加入到过滤除菌后的壳聚糖溶液中，在室温、无菌条件下搅拌5-10min，得到混合溶液C；所述猪流行性腹泻病毒系病毒液中的病毒为猪流行性腹泻病毒SZ株；所述猪流行性腹泻病毒系病毒液的滴度为10⁷TCID 50/mL；

三、将混合溶液C在室温、无菌条件下搅拌均匀，然后滴加过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液，在保持搅拌速度不变的条件下继续搅拌，得到混合溶液D；

四、将混合溶液D于4℃下离心20-30min，去上清液，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3-5遍，收集固相物E；

五、将固相物E加入到4℃的无菌去离子水中，真空冷冻干燥24-26h，得到猪流行性腹泻病毒/壳聚糖纳米疫苗。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中乙酸的体积浓度为34％-38％。

3.根据权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤二中病毒液A与过滤除菌后的壳聚糖溶液的体积比为2:(5-6)。

4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤二中搅拌速度为300-400r/min。

5.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中搅拌速度为900-1300r/min。

6.根据权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中混合溶液C与过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液的体积比为7:(2-3)。

7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中第一次搅拌的时间是10-15min。

8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中第二次搅拌的时间是20-50min。

9.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤三过滤除菌后的三聚磷酸钠溶液的滴加速度为0.005-0.007mL/s。

10.根据权利要求1、2或9所述的猪流行性腹泻病毒纳米疫苗的制备方法，其特征在于步骤四中离心速度为12000-13000r/min。