[发明专利]一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

说明书

本发明涉及一种基于化学交联质谱的蛋白质复合物分析中，单端反应肽段的去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用。应用分体式可断裂可富集交联试剂，使用与交联肽段富集基团相同的封闭试剂，可在不增加实验步骤的基础上，同时实现交联肽段的富集和单端反应肽段的去除，从而提高两端交联肽段的鉴定数目和可信度。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质相互作用的分析。

技术领域

本发明涉及一种降低单端交联肽段丰度，从而降低交联样品复杂度，进而提高交联肽段鉴定及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用。

背景技术

交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术，它利用化学交联剂将细胞内空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学对交联产物进行分析，从而实现对蛋白质的空间结构及蛋白质间相互作用方式的解析(Sinz,A.,Expert Rev.Proteomics.,2014,11(6):733-743.)。

然而，使用传统交联质谱技术对质谱鉴定要求很高。由于每个位点的实际交联效率往往远低于100％，所以交联肽段丰度偏低，交联谱图数目少、信号差，给交联谱图鉴定带来困难。此外，对于复杂蛋白质复合体样品，进入质谱分析之前，需要对其进行酶切。交联蛋白质在不同位置发生酶切会生成三种产物：a.被交联剂修饰的单肽，即交联剂一端发生水解，仅一端与肽段进行反应(Type-0型肽段)；b.肽段内部交联，即交联剂两端结合位点在同一条肽段上(Type-1型交联肽段)；c.肽段间交联，即交联剂两端结合位点分别在两条肽段上(Type-2型交联肽段)。由于交联试剂两侧的反应基团水解速率快，Type-0型肽段含量远高于蛋白质相互作用解析所需的Type-1型和Type-2型交联肽段。

为提高交联肽段的丰度，目前已发展出含有不同类型富集基团(如炔基-叠氮、生物素-亲和素等)的交联试剂，然而，由于三种产物中均含有交联剂，因此使用含常规富集基团的交联试剂无法将交联肽段与Type-0型肽段进行分离，使得其大大干扰具有蛋白质结构及位点信息的Type-1和Type-2型交联肽段的鉴定。

本发明使用连接臂上含有富集把手的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，在交联反应完成后，对未反应且未水解的交联剂功能基团进行封闭使其修饰上富集基团；接着对交联蛋白样品进行点击化学反应，使其交联剂连接臂上的富集把手连接上与封闭试剂同样的富集基团。通过蛋白沉淀将多余的小分子试剂去除后，将蛋白质样品进行酶解，选择性富集交联肽段包括Type-0、Type-1和Type-2型。接着使用化学切割或者光切割方法使得Type-1和Type-2型肽段释放下来，而Type-0型肽段由于另一端封闭试剂的富集臂中并无断裂基团，因此并不会被释放下来，实现了单端反应肽段的去除从而降低交联肽段样品的复杂度；对交联肽段进行高准确度的鉴定，即可获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并可应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。

发明内容

为了克服常规化学交联方法交联样品复杂，交联肽段丰度低，无法实现对交联肽段选择性富集等问题，本发明提供一种使用分体式交联试剂，在其交联反应结束后用封闭试剂对其未反应的功能基团进行封闭，随后采用高特异性富集材料选择性富集交联肽段并高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：