[发明专利]一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

权利要求书

1.一种单端交联肽去除方法，其特征在于：在蛋白进行化学交联后，使用一端为与交联剂连接臂上富集基团相同、另一端为可与交联剂功能基团反应的基团的试剂进行封闭，从而实现将交联剂单端未反应的基团连接上富集基团，进而在对交联肽段进行富集的同时对其进行去除，只释放两端交联肽段，降低交联样品的复杂度，提交质谱鉴定的数目及可信度，为匹配其在蛋白质复合物的位点信息提供依据；

具体包括：

（1）对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮，得细胞样品溶液；或，对于从细胞中提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液，得蛋白样品溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂中的一种或二种以上配制成交联剂溶液；

（2）将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；

（3）交联反应完成后，对于细胞样品，加入封闭试剂，进行细胞破碎；对于蛋白样品，直接加入封闭试剂进行单端肽段的封闭反应；

（4）加入分体式富集试剂，使交联蛋白修饰上富集臂；

（5）进行一步蛋白沉淀，去除多余未反应的富集试剂；

（6）采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的蛋白质溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；

（7）加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解；

（8）向步骤（7）的酶解产物中加入富集材料；

（9）使用高浓度的盐溶液或表面活性剂洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；

（10）使用具有洗脱能力的溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析得到交联肽段的序列信息，数据检索得到交联肽段对应的酶解前蛋白质结构及蛋白相互作用的信息；

步骤（1）中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1 µM-1 M；

所述的交联剂为两侧具有相同的与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种；或为与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种；或为与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种；或为两侧具有与蛋白上任意基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团、双吖丙啶基团中的一种；所述的交联剂，其两端活性反应基团为上述任一反应基团；所述的交联剂，其连接臂上的富集基团，为叠氮基或炔基，连接臂为C3-C20的烷烃；

步骤（3）中所述的封闭试剂结构为一端具有能与交联剂功能基团特异性反应的基团，包括氨基、巯基、羧基中的一种，一端为与交联剂相同的如生物素、磷酸基团具有富集功能的基团中的一种；步骤（4）中分体式富集试剂一端为炔基或叠氮基团可与交联剂连接臂上的富集基团反应，一端为生物素具有富集功能的基团，中间具有一个高效的化学断裂基团，如重氮苯可被连二亚硫酸钠迅速还原；

步骤（1）中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；

步骤（1）中所述的细胞样品，为胰蛋白酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤（1）中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1 µg/mL-100 mg/mL；步骤（1）中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或二种以上；步骤（8）中所述的富集材料修饰有可与具有富集功能的基团如生物素高特异性结合的如链霉亲和素的富集基团；富集基团连接在基质上；

所述富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、磁球或聚合物球有机/无机材料；

步骤（10）中交联肽段释放溶液为切割化学可断裂基团的试剂，如连二亚硫酸钠溶液，其将重氮键还原为氨基。