[发明专利]一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒，所述试剂盒用于人肝素结合蛋白的胶乳增强免疫比浊法检测，所述试剂盒包括试剂1、试剂2和校准品，其特征在于：所述试剂2中包含标记人肝素结合蛋白单抗的大球胶乳微球和标记人肝素结合蛋白单抗的小球胶乳微球，所述大球胶乳微球与所述小球胶乳微球的粒径差值至少为200nm，所述小球胶乳微球的表面电荷值比所述大球胶乳微球的表面电荷值大至少100μeq/g。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述大球胶乳微球的粒径范围为280-400nm，所述小球胶乳微球的粒径范围为80-180nm。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述小球胶乳微球的表面电荷为120-200μeq/g，所述大球胶乳微球的表面电荷为20-100μeq/g。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述大球胶乳微球与所述小球胶乳微球上标记相同的人肝素结合蛋白单抗。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述大球胶乳微球与所述小球胶乳微球的重量比为1:1-1:10。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述大球胶乳微球和所述小球胶乳微球均为带有羧基的聚苯乙烯微球。

7.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂2中还包含缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和电解质；

优选的，所述试剂2的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，优选的，4-羟乙基哌嗪乙磺酸在试剂2中的浓度为10-100mmol/L，优选为50mmol/L；

优选的，所述试剂2的稳定剂为牛血清白蛋白、蔗糖和海藻糖中的至少一种，优选的，稳定剂在试剂2中的浓度为0.2％w/v-10％w/v，优选的，稳定剂为牛血清白蛋白，且牛血清白蛋白在试剂2中的浓度为0.2％w/v；

优选的，所述试剂2的表面活性剂为吐温20，优选的，吐温20在试剂2中的浓度为0.05％-0.5％，优选为0.1％；

优选的，所述试剂2的防腐剂为叠氮钠，优选的，叠氮钠在试剂2中的浓度为0.05％w/v-0.15％w/v，优选为0.1％w/v；

优选的，所述试剂2的电解质为氯化钠，优选的，氯化钠在试剂2中的浓度为10-50mmol/L，优选为20mmol/L。

8.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂1中包含缓冲溶液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂和稳定剂；

优选的，所述试剂1的缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷，优选的，三羟甲基氨基甲烷在试剂1中的浓度为10-100mmol/L，优选为50mmol/L；

优选的，所述试剂1的表面活性剂为Triton X-100，优选的，Triton X-100在试剂1中的浓度为0.05％w/v-0.3％w/v，优选为0.1％w/v；

优选的，所述试剂1的电解质为氯化钠，优选的，氯化钠在试剂1中的浓度为50-200mmol/L，优选为150mmol/L；

优选的，所述试剂1的防腐剂为叠氮钠，优选的，叠氮钠在试剂1中的浓度为0.05％w/v-0.1％w/v，优选为0.1％w/v；

优选的，所述试剂1的反应促进剂为聚乙二醇10K，优选的，聚乙二醇10K在试剂1中的浓度为0.5％w/v-3％w/v，优选为2％w/v；

优选的，所述试剂1的稳定剂为牛血清白蛋白，优选的，牛血清白蛋白在试剂1中的浓度为0.05-0.2mg/mL，优选为0.1mg/mL。

9.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品由若干个含已知浓度的人肝素结合蛋白抗原的样品组成，所有样品中人肝素结合蛋白抗原的浓度范围为0-1000ng/mL；

优选的，校准品由六个样品组成，六个样品中人肝素结合蛋白抗原的浓度依序为0ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

10.根据权利要求1-9任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

试剂1的制备，包括根据试剂1的配比称取各组分，将各组分溶解于部分水或试剂1的缓冲溶液中，常温搅拌至固体完全溶解，并将pH调至7.50，然后再采用水或试剂1的缓冲溶液定容，即获得所述试剂1；

试剂2的制备，包括分别对所述大球胶乳微球和所述小球胶乳微球进行处理，具体处理方法为，将胶乳微球的悬浮液用2-(N-吗啉基)乙硫磺缓冲液稀释，加入N-羟基丁二酰亚胺搅拌溶解后，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸，2-8℃搅拌1小时后，10000-15000rpm离心10-30分钟，去上清液，然后加入2-(N-吗啉基)乙硫酸，超声分散得到活化的胶乳微球悬浮液；将人肝素结合蛋白单抗加入活化的胶乳微球悬浮液中，室温下搅拌2-4小时，加入封闭液封闭反应，离心去上清，采用试剂2的缓冲液体系清洗三次后，采用试剂2的缓冲液体系重悬，超声分散，即获得人肝素结合蛋白单抗标记的胶乳微球，其中，试剂2的缓冲液体系包含缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和电解质；将标记人肝素结合蛋白单抗的大球胶乳微球和标记人肝素结合蛋白单抗的小球胶乳微球混合，即获得所述试剂2；

校准品的制备，包括制备抗原缓冲液，并将人肝素结合蛋白抗原溶解于抗原缓冲液中，制成已知人肝素结合蛋白抗原浓度的样品，即获得所述校准品；

优选的，所述抗原缓冲液中含有50mmol/L的Tris-HCl、150mmol/L的KCl、5mmol/L的CaCl₂、5％w/v的牛血清白蛋白、10％重量份的甘露醇、叠氮钠，并且，抗原缓冲液的pH值为7.5；

优选的，所述校准品由六个已知人肝素结合蛋白抗原浓度的样品组成，六个样品中人肝素结合蛋白抗原的浓度依序为0ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；

优选的，所述标记人肝素结合蛋白单抗的大球胶乳微球采用的封闭液为pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的甘氨酸、pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的乙醇胺、pH7.0-9.0浓度为1％-5％的牛血清白蛋白和pH7.0-9.0浓度为1％-5％的酪蛋白中的至少一种；所述标记人肝素结合蛋白单抗的小球胶乳微球采用的封闭液为pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的甘氨酸、pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的乙醇胺、pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的赖氨酸和pH7.0-10.0浓度为0.1-1.0mol/L的丙氨酸中的至少一种。