[发明专利]一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用

权利要求书

1.一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法至少包括如下步骤：

（1）对人脂肪间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加诱导剂；

（2）对培养后的干细胞进行预处理；

（3）在预处理后的培养基上清液中提取所述的人脂肪间充质干细胞源外泌体；

（4）外泌体制剂的制备。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体为间充质干细胞分化而来。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞源为人脂肪间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，其特征在于，还包括一种人脂肪间充质干细胞的培养方法：

（1）取吸脂术后脂肪30mL，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除筋膜及红细胞后，加入30ml的0.075%Ⅰ型胶原酶[7-11]，在37℃、150r/min的条件下，消化,40-45min；

（2）加入等体积含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化，15 000 r/min离心10min，去除上层油脂及中层清液，用5mL红细胞裂解液重悬，室温静置5 min，1000r/min离心5 min；

（3）去除上清液，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，70μm细胞筛网过滤后，移入培养皿行原代培养，每隔三天换液，细胞浓度融合生长至70%-80%时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代培养；

（4）取3-6代细胞，细胞融合生长至70-80%时，换无血清培养基培养24-48h，收集细胞上清液，收集的细胞上清液保存于-80℃冰箱。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，还包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的提取方法：

（1）在4℃、无菌条件下，将收集的上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片；10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡；再用0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体；

（2）用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体；

（3）106×g离心70min，去除清液，用100μLPBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。

6.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的应用，其特征在于，包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的冻干粉美容制剂制备方法：

（1）取外泌体，加入10%的甘露醇，混匀后用0.22 μm针头滤器过滤，分装后放入-80℃冰箱10小时。

7.然后再真空下进行冻干（-50℃，24h），得到人间充质干细胞外泌体冻干粉；

（2）称取外泌体冻干粉10mg，葡糖胺基葡聚糖15mg，透明质酸15mg，海藻糖10mg，溶解于100ml甘油中，混合搅拌至透明状，用0.22μm针头滤器过滤，即得到所述美容制剂。