[发明专利]一种提高神经营养因子NT-3碱性蛋白产量的蛋白改造方法

说明书

本发明属于基因技术和微生物技术领域，具体涉及一种提高神经营养因子NT‑3碱性蛋白产量的蛋白改造方法，包括：以小鼠肝脏组织或脑组织提取的RNA经反转录制备的cDNA模板，以F1/R1为引物对，通过点突变扩增技术将原始基因序列中“第22位～第28位”的碱基序列“CGAGGAG”同义突变成“CGCGGCG”；将改造后的基因片段构建到pET 32a表达载体中，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达，纯化获得神经营养因子NT‑3碱性蛋白。经本发明所述方法改造后的基因序列在诱导表达神经营养因子NT‑3碱性蛋白时获得了分子量大小符合预期的目的蛋白，实现了神经营养因子NT‑3碱性蛋白的正常表达。

技术领域

本发明属于基因技术和微生物技术领域，具体涉及一种提高神经营养因子NT-3碱性蛋白产量的蛋白改造方法。

背景技术

神经营养因子由靶组织分泌，通过阻止相关神经元启动程序性细胞死亡，从而使神经元得以存活。神经营养因子还诱导祖细胞分化，形成神经元。神经营养因子是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，其成员包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4(NT-4)等，神经营养因子通常在神经末梢以受体介导式入胞的方式进入神经末梢，再经逆向轴浆运输抵达胞体，促进胞体合成有关的蛋白质，从而发挥其支持神经元生长、发育和功能完整性的作用。近年来，也发现有些神经营养因子由神经元产生，经顺向轴浆运输到达神经末梢，对突触后神经元的形态和功能完整性起支持作用。这些蛋白质是治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。

NT-3是一种小分子量的碱性蛋白，分子量约14KDa,其等电点为9.3，成熟的NT-3分子由119个氨基酸组成。近年来研究表明NT-3的功能广泛，可在体内或离体调节周围和中枢神经系统神经元形态；可促进神经干细胞(NSCs)向神经元分化，减少分化为胶质细胞；维持胚胎发育中神经元的存活、促进其分化与增殖；诱导其轴突生长以及调控成熟神经元的生理功能以及促进脊髓损伤后神经修复及功能恢复。有研究发现，NT-3在临床有治疗作用，由于NT-3的生理作用，它有可能对周围神经炎、颅脑伤、脊髓损伤、肌肉萎缩性侧索硬化症、老年痴呆症、神经系统肿瘤均有治疗效果。也有研究表明NT-3对由糖尿病引起的外周神经疾病也有一定的治疗潜力。

鉴于NT-3有着非常重要的作用，能有效正确的表达该蛋白就显得非常重要。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种提高神经营养因子NT-3碱性蛋白产量的蛋白改造方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种提高神经营养因子NT-3碱性蛋白产量的蛋白改造方法，包括如下步骤：

(1)神经营养因子NT-3碱性蛋白的原始基因序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以小鼠肝脏组织或脑组织提取的RNA经反转录制备的cDNA模板，以F1/R1为引物对，通过点突变扩增技术将原始基因序列中“第22位～第28位”的碱基序列“CGAGGAG”进行同义突变，得到新的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将步骤(2)所得序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段构建到pET 32a表达载体中，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达，纯化获得神经营养因子NT-3碱性蛋白。

上述方案中，所用引物F1/R1序列如下：

F1:5′-CCGGAATTC TATGCAGAACATAAGAGTCACCGCGGCGAG-3′EcoRI

R1:5′-CCGCTCGAG TGTTCTTCCAATTTTTCTCGACAAGGC-3′XhoI