[发明专利]一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用

说明书

一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用，属于卵母细胞体外成熟培养技术领域。为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本发明所述的培养液由基础培养液TCM‑199，青霉素，链霉素，NaHCO₃，4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素，人绒毛膜促性腺激素和单宁酸组成。本发明所述的培养液，可以提高卵母细胞体外成熟质量、卵丘细胞扩散指数、孤雌胚胎囊胚率和囊胚总细胞数、体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

技术领域

本发明属于卵母细胞体外成熟培养技术领域。具体涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。

背景技术

现代生物学和生物医学研究表明猪的生物学特性和遗传特性与人类具有相当高的同源性，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物。体外培养技术和当今飞速发展的基因编辑技术的有效结合，不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎体外生产(IVP)的重要一环，如今对猪卵母细胞体外成熟培养(IVM)的标准也在不断的提升。尽管现在猪的卵母细胞IVM体系得到了很大的改善，但是猪卵母细胞体外成熟率仍然低于体内。

随着动物胚胎工程的发展，科研和生产方面对于卵母细胞的需求越来越大。传统的超数排卵获得成熟的卵母细胞已远远满足不了当前对卵母细胞的需求，哺乳动物卵母体外成熟一直是研究卵母细胞体外培养、体外受精和胚胎发育等关键步骤，也一直是研究热点和难点。与卵母细胞体内成熟相比，卵母细胞体外成熟存在细胞核和细胞质成熟不协调、不同步问题，这直接导致卵子发育潜力受阻，表现为体外受精胚胎发育率低和胚胎质量差等，表明卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有较强的相关性。所以深入探索卵母细胞的成熟规律，改善卵母细胞体外成熟的培养环境，建立一种完善的卵母细胞体外成熟体系，是当前胚胎工程研究的重要内容之一。

发明内容

为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本发明所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，含有单宁酸。

优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO₃，4-羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素PMSG，人绒毛膜促性腺激素hCG和单宁酸组成。

优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048-0.066g/L，链霉素的质量浓度为0.08-0.12g/L，NaHCO₃的浓度为1.95-2mmol/L，Hepes的浓度为9.5-10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5-3.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.9-0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为8-12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5-0.7mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8-12ng/mL，猪卵泡液体积浓度为75-125mL/L，PMSG的浓度为8-12IU/mL，hCG的浓度为8-12IU/mL，单宁酸的浓度为1-50μg/mL。

优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，NaHCO₃的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，胰岛素的质量浓度为10ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.6mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为10ng/mL，猪卵泡液体积浓度为100mL/L，PMSG的浓度为10IU/mL，hCG的浓度为10IU/mL，单宁酸的浓度为10μg/mL。

本发明还提供了所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：