[发明专利]一种同时检测多种病原微生物的引物探针组合、试剂盒以及方法

权利要求书

1.一种同时检测多种病原微生物的引物探针组合，其特征在于，该引物探针组合包括：

用于检测呼肠孤病毒的如SEQ ID NO：1-2所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：3所示的特异性探针；

用于检测牛细小病毒的如SEQ ID NO：4-5所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：6所示的特异性探针；

用于检测蓝舌病毒的如SEQ ID NO：7-8所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：9所示的特异性探针；

用于检测牛腹泻病毒的如SEQ ID NO：10-11所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：12所示的特异性探针；

用于检测牛多瘤病毒的如SEQ ID NO：13-14所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：15所示的特异性探针；以及

用于检测狂犬病毒的如SEQ ID NO：16-17所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：18所示的特异性探针。

2.根据权利要求1所述的同时检测多种病原微生物的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针的5’端修饰的活性有机基团为氨基。

3.根据权利要求1所述的同时检测多种病原微生物的引物探针组合，其特征在于，所述特异性引物中的SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16的5’端修饰有生物素标记。

4.一种同时检测多种病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任意一项所述的同时检测多种病原微生物的引物探针组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中12条特异性引物的摩尔浓度比值为：SEQ ID NO.1﹕SEQ ID NO.2﹕SEQ ID NO.4﹕SEQ ID NO.5﹕SEQ ID NO.7﹕SEQ ID NO.8﹕SEQ ID NO.10﹕SEQ ID NO.11﹕SEQ ID NO.13﹕SEQ ID NO.14﹕SEQ ID NO.16﹕SEQ ID NO.17＝1.5﹕1.5﹕2.0﹕2.0﹕3.0﹕3.0﹕2.0﹕2.0﹕1.5﹕1.5﹕2.0﹕2.0。

6.一种液相芯片技术检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，根据呼肠孤病毒、牛细小病毒、蓝舌病毒、牛腹泻病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒的基因序列分别设计合成对应的具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的呼肠孤病毒探针、具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的牛细小病毒探针、具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的蓝舌病毒探针、具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的牛腹泻病毒探针、具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的牛多瘤病毒探针和具有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的狂犬病毒探针；

S2，将呼肠孤病毒探针、牛细小病毒探针、蓝舌病毒探针、牛腹泻病毒探针、牛多瘤病毒探针、狂犬病毒探针分别与第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球相连，分别获得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液；

S3，将呼肠孤病毒、牛细小病毒、蓝舌病毒、牛腹泻病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒阴性样品，经DNA抽提和PCR扩增获得PCR产物，将第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液混合形成混合偶联微球的探针溶液，然后将PCR产物加入混合偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，根据该信号确定阈值；

S4，将待测样品，经DNA抽提和PCR扩增获得待测PCR产物，将待测PCR产物加入混合偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，与阈值比较，判断待测样品为阴性或阳性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼肠孤病毒探针、牛细小病毒探针、蓝舌病毒探针、牛腹泻病毒探针、牛多瘤病毒探针、狂犬病毒探针的Tm值保持在56℃-58℃。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，获得待测PCR产物具体方法包括如下步骤：

P1，提供用于检测呼肠孤病毒的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列的特异性引物对，用于检测牛细小病毒的SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列的特异性引物对，用于检测蓝舌病毒的SEQ ID NO：7-8所示的核苷酸序列的特异性引物对，用于检测牛腹泻病毒的SEQ IDNO：10-11所示的核苷酸序列的特异性引物对，用于检测牛多瘤病毒的SEQ ID NO：13-14所示的核苷酸序列的特异性引物对，以及用于检测狂犬病毒的SEQ ID NO：16-17所示的核苷酸序列的特异性引物对，其中，所述特异性引物中的SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16的5’端修饰有生物素标记；以及

P2，利用所述特异性引物对扩增，分别获得呼肠孤病毒目的基因、牛细小病毒目的基因、蓝舌病毒目的基因、牛腹泻病毒目的基因、牛多瘤病毒目的基因、狂犬病毒目的基因及包含呼肠孤病毒目的基因、牛细小病毒目的基因、蓝舌病毒目的基因、牛腹泻病毒目的基因、牛多瘤病毒目的基因、狂犬病毒目的基因的多重PCR产物。