[发明专利]一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌

说明书

本发明公开了一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌，属于微生物工程技术领域。本发明以提高大肠杆菌对D‑乳酸胁迫抗性为目的，以适应性进化为方法，筛选得到了一株可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品发酵生产的大肠杆菌，筛选得到的菌株Escherichia coli DLA3胁迫4h后，存活率较出发菌株提高了249.0倍。

技术领域

本发明涉及一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。

目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

乳酸的学名为α-羟基丙酸，分子式为C₂H₅OCOOH，是一种天然存在的有机酸。D-乳酸主要应用于聚乳酸材料的加工制造以及手性药物和农药中间体的合成。高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。同时其最主要应用于生物塑料聚乳酸的原料。在大肠杆菌中，D-乳酸通过丙酮酸代谢途径产生，野生型大肠杆菌菌株就具有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸。但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素，大肠杆菌适应生长环境为中性，可乳酸生产环境的pH值适宜在pH 5.5以上，但约50g·L^-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右，这对大肠杆菌的生长是一种考验。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高大肠杆菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种新的效果优异、遗传稳定性好、成本低、成功率高、操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌(Escherichia coli)，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019676，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

本发明的第二个目的是提供含有上述大肠杆菌的微生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥10⁶CFU/g的大肠杆菌干菌体。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥10⁶CFU/mL的大肠杆菌湿菌体。

本发明的第三个目的是提供一种增强大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，是以上述大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是乳酸胁迫。

本发明的第四个目的是提供上述大肠杆菌在食品领域中的应用。