[发明专利]用于肺炎支原体的CRISPR检测引物组及其用途

说明书

本发明涉及一种用于肺炎支原体的CRISPR检测引物组及其用途，属于CRISPR技术的基因检测技术领域。该引物组包括扩增引物对和crRNA；所述扩增引物对用于扩增肺炎支原体如SEQ ID NO.1所示序列；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述SEQ ID NO.1序列中的靶向序列片段相匹配。采用该引物组以CRISPR技术检测肺炎支原体，缩短了肺炎支原体的检测时间，可在60min内完成检测。本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可达30copies。并且采用该引物组对肺炎支原体进行CRISPR检测，摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR‑Cas技术在肺炎支原体的即时诊断方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基于CRISPR技术的基因检测技术领域，特别是涉及一种用于肺炎支原体的CRISPR检测引物组及其用途。

背景技术

肺炎支原体感染(Mycoplasma pneumonia infection)广泛存在于世界各地，感染通过患者咳嗽时喷出的飞沫实现人际传播，约80％的患者会出现明显的临床表现，通常表现为咽炎、气管支气管炎、反应性气道疾病/喘息或非特异性上呼吸道综合征。肺炎支原体的潜伏周期为2～4周，因此特定的人群感染会持续长达数周。肺炎支原体疾病通常发生在军事基地、寄宿学校和夏令营等人口密集的场所，儿童的家族内感染率为84％，而成人为41％，感染往往呈地方性而没有季节性，每4～7年发生一次散发性流行。

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)是儿童与成人社区获得性呼吸系统疾病的主要原因。它通常被认为是一种细胞外病原体，通过其末端顶部复杂的终端细胞器附着于纤毛呼吸上皮细胞，细胞粘附由聚集于细胞器且能够相互作用的黏附素和辅助蛋白所介导，在细胞外附着后对宿主的呼吸组织造成损伤。

口咽、鼻咽和肺部标本都可用于诊断肺炎支原体肺炎，其它体液如脑脊液可用于诊断肺炎支原体肺外感染。目前临床上难以通过患者的临床表现来区分肺炎支原体肺炎和其它类型的社区获得性肺炎，非微生物实验室检查和胸部影像学检查也同样不能够区分。此外，由于缺乏细胞壁，革兰氏染色无法看到肺炎支原体。历史上采用过冷凝集滴度检测，但其结果不具有特异性，目前也不再推荐使用该方法诊断肺炎支原体。目前，培养是诊断肺炎支原体感染的金标准方法，但是需要特殊的培养基，而且确定结果需要1～2周，常常很难从临床标本中分离出来，因此很少进行，不建议用于常规诊断。血清学的诊断方法是通过检测配对(急性期和缓解期)血清样本中的肺炎支原体的IgM和IgG抗体来确诊，酶联免疫分析是推荐的血清学检测方法。市场上已经有血清学方法如颗粒凝集(PA)，补体结合(CF)，和快速诊断诸如(IC)(免疫球蛋白支原体M[IgM型])用于检测。虽然少数实验室可以使用基于PCR的分子诊断，但以血清学诊断作为参考标准时，肺炎支原体感染的灵敏度和特异性分别为40.7％～66.7％和88.8％～98.5％。LAMP(Loop-mediated isothermalamplification，环介导等温扩增技术)是用于咽拭子样本快速检测肺炎支原体的新的核酸扩增方法，可以快速(在几个小时内)、低成本地检测肺炎支原体感染，在检测灵敏度和特异性上同PCR相当。当将LAMP测定与经验证的实时定量PCR测定进行比较时，LAMP测定的灵敏度在提取的核酸上测试为88.5％，在未提取的临床样本上为82.1％。肺炎支原体最佳检测样本位点在病原体或年龄方面有所不同，在通过核酸扩增方法检测成人患者的肺炎支原体时，痰液可能优于鼻咽拭子或口咽拭子。

重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最佳反应温度为37℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量PCR(qPCR)检测方式，并不能有实质性的灵敏度提升。

发明内容