[发明专利]一种耐高盐的酿酒酵母菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种耐高盐的酿酒酵母菌株、其构建方法及应用。在该技术方案中，提取米曲霉3042的油酸合成酶编码基因，通过载体转化至天然酵母菌株中，所得的重组菌单独表达来源于米曲霉3042的油酸合成酶(Oleic acid synthase，Ole)。根据其形态特征及其26S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。实验验证表明，本发明菌株可以在酱油酿造的高盐环境下生长繁殖，相对于现有菌株，其不饱和脂肪酸含量更高。以其作为酱油酿造菌株，可在高盐条件下保证发酵过程的顺利进行并在一定程度上缩短发酵周期，而且使产品具有更高的不饱和脂肪酸含量，是酱油酿造的优良菌株。

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种耐高盐的酿酒酵母菌株、其构建方法及应用。

背景技术

酱油是我国最主要的传统调味品之一，曲霉和酵母是酱油酿造中主要的发酵微生物，这些微生物的蛋白酶可以将原料中的蛋白质降解为易于人体吸收的小分子和多肽，同时这些微生物的代谢产物，如小分子醇、醛、酸、酯、不饱和脂肪酸、酚类等，也可以为酱油提供风味。

根据酱油酿造发酵工艺的不同，可分为固态无盐、低盐固态和高盐稀态。固态无盐、低盐固态发酵提供的产品以中低档产品为主，产品风味不及高盐稀态发酵工艺。随着人民生活水平的不断提高，市场对优质酿造调味品的需求越来越强烈，无盐和低盐固态发酵产品已不能满足市场需求。高盐稀态发酵(10％-15％NaCl)的酱油口感好，不饱和脂肪酸含量丰富，多为高档出口产品。在高盐稀态发酵过程中，为了提高酱油的风味，一般都需要添加耐盐酿酒酵母，从而改善酱油酿造工艺中用米曲霉发酵所导致的风味单一及不饱和性，以全面提高酱油的风味及档次。

目前常用的酿酒酵母菌株在10％的盐浓度下生长受到严重抑制，并且不饱和脂肪酸含量低，尤其是油酸的含量只有7％左右。油酸是一种重要的单不饱和脂肪酸，对于酵母的逆境耐受性，如乙醇耐受性、盐胁迫耐受性等都有着重要的作用。高盐稀态环境会引起酿酒酵母的细胞内水分活度、细胞质组成发生显著变化，细胞膜和菌体内的酶受到破坏，从而抑制酵母的生长和发酵。因此，选育耐高盐的酿酒酵母对改善酱油风味、提高酱油质量非常重要。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种耐高盐的酿酒酵母菌株、其构建方法及应用，以解决现有技术中常规酿酒酵母菌株的耐盐性有待提升的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是，常规酿酒酵母菌株的不饱和脂肪酸含量较低。

本发明要解决的再一技术问题是，如何通过基因工程手段改善常规酿酒酵母菌株的耐盐性及不饱和脂肪酸含量。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种耐高盐的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，其保藏编号为CGMCCNO：14916。

作为优选，该酿酒酵母菌株的26S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)提取米曲霉3042的总RNA，而后反转录合成cDNA第一链，以其为模板、以序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.4的片段为引物进行PCR扩增；

2)将步骤1)的扩增产物用T4连接酶连接到T载体上，用限制性内切酶双酶切消化并克隆载体pMD19，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化宿主菌，对转化菌进行培养扩增，挑选阳性克隆子提取质粒，挑选测序正确的转化子；阳性克隆与表达载体PYES2用限制性内切酶双酶切消化，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，挑选含有目的基因的重组质粒；