[发明专利]一种耐高盐的酿酒酵母菌株、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种耐高盐的酿酒酵母菌株，其保藏编号为CGMCC NO：14916。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于该酿酒酵母菌株的26S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取米曲霉3042的总RNA，而后反转录合成cDNA第一链，以其为模板、以序列为SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.4的片段为引物进行PCR扩增；

2)将步骤1)的扩增产物用T4连接酶连接到T载体上，用限制性内切酶双酶切消化并克隆载体pMD19，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化宿主菌，对转化菌进行培养扩增，挑选阳性克隆子提取质粒，挑选测序正确的转化子；阳性克隆与表达载体PYES2用限制性内切酶双酶切消化，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，挑选含有目的基因的重组质粒；

3)将步骤2)所得的重组质粒转化至感受态的酵母细胞中，所得的转化子即为所述耐高盐的酿酒酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤3)中所述的转化，是将含有所述重组质粒的预混液与感受态的酵母细胞混合，使酵母细胞悬浮在预混液中；而后以30℃水浴30min，每10min混匀一次；再以42℃水浴热击30min，每10min混匀一次。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述预混液包括以下成分：PEG 240μL，1M的LiAc 36μL，Carrier DNA 10μL，所述重组质粒5μL；加无菌去离子水补齐至360μL。

6.权利要求1所述酿酒酵母菌株用于酿造酱油的应用。

7.权利要求1所述酿酒酵母菌株用于执行发酵的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在该应用中，以如下培养基作为所述酿酒酵母菌株的种子培养基或发酵培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g加水至1000mL；pH7.0，110℃灭菌20min。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在该应用中，种子培养条件如下：挑取单菌落接种至容器中，容器中种子培养基的装液量为其总体积的1/5；以30℃，200r/min的转速摇瓶培养24h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在该应用中，发酵培养条件如下：将种子培养所得的培养液以10％(v/v)的比例接种至另一容器中，该容器中发酵培养基的装液量为其总体积的1/10；以30℃，200r/min的转速摇瓶培养48h。