[发明专利]基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法有效

专利信息
申请号: 201911183868.9 申请日: 2019-11-27
公开(公告)号: CN110964817B 公开(公告)日: 2022-09-23
发明(设计)人: 黎泓波;蒲嘉美;刘明彬;赵卫华;王素琴 申请(专利权)人: 江西师范大学
主分类号: C12Q1/6886 分类号: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
代理公司: 郑州优盾知识产权代理有限公司 41125 代理人: 冉珊敏
地址: 330022 *** 国省代码: 江西;36
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摘要:
搜索关键词: 基于 核酸外切酶 功能 发夹 探针 组合 提高 检测 pax 基因 灵敏度 方法
【说明书】:

发明属于分子生物学领域,特别是指基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax‑5a基因灵敏度的方法。所述功能化发夹探针序列如SEQ ID No.1所示,该功能化发夹探针包括G‑四链体片段和3’凹陷末端区域。包含功能化发夹探针的检测组合物,还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。本发明的发夹探针引入了G‑四链体序列;同时形成了3’凹陷末端,便于核酸外切酶Ⅲ的剪切,降低了背景信号的干扰;并且设计的发夹探针是能够识别目的基因的多功能实体;通过引物和DNA聚合酶的作用,实现了目标基因的循环利用,放大了检测信号,降低了检测下限,使得最低检测限达60.1 fM。

技术领域

本发明属于分子生物学领域,特别是指基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法。

背景技术

Pax-5是在造血系统中发现的唯一paired-box(PAX)家族成员,它可以分为Pax-5a,Pax-5b,Pax-5c,Pax-5d和Pax-5e。其中,Pax-5a是最重要的,Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5对于B细胞分化和发育非常重要,其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而,目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。

光谱法有荧光光谱法和紫外光谱法。由于其测试时操作简单,数据稳定性较为理想,所以运用范围较为广泛,也是核酸检测中不可或缺的手段。其中荧光光谱法需要额外标记荧光物质,过程繁琐,且存储环境较为严苛;而紫外光谱法则不需要进行繁琐的标记处理。

G-四链体是由四个鸟嘌呤(G)碱基首尾相连通过π-π堆积进一步形成的特殊类型的DNA二级结构。近年来,G-四链体受到科学家们越来越多的关注,并已被应用于抗癌治疗的研究。G-四链体与小分子结合后形成的G-四链体DNAzyme具有高稳定性和过氧化物酶模拟活性的优点,其广泛用于生物传感器的构建。例如,G4序列与氯化血红素结合可以催化双氧水氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺,能够产生被检测到的紫外吸收峰。

现有的检测Pax-5基因突变检测方法,种类比较少且灵敏度低。

发明内容

本发明提出一种基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法,解决现有检测Pax-5基因突变检测方法,种类比较少且灵敏度低的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的:

基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针,所述功能化发夹探针序列如SEQ ID No.1所示,该功能化发夹探针包括G-四链体片段和3’凹陷末端区域,其空间二级结构为:其中,区域Ⅰ为G-四链体序列,区域Ⅱ为目标基因结合序列。

包含功能化发夹探针的检测组合物,还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。

所述引物序列如SEQ ID No.2所示,DNA聚合酶为Klenow Fragment。

利用包含功能化发夹探针的组合物提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法,步骤如下:

(1)将发夹探针、引物以及梯度浓度的Pax-5a的标准溶液在反应管中混合,加入缓冲液体系,37℃孵育1小时后,再加入5 U DNA聚合酶、10 mM三磷酸碱基脱氧核苷酸,37℃孵育2小时,然后加热使酶失活;

(2)经过步骤(1)处理的溶液冷却至室温,加入100 U核酸外切酶Ⅲ,37℃孵育1小时,然后加热使酶失活;

(3)经过步骤(2)处理的溶液冷却到室温时,加入氯化血红素溶液,37℃孵育35-40分钟;

(4)向经步骤(3)处理的溶液里加入HEPES缓冲液、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液,反应10-15分钟后,采用紫外可见分光光度计检测350-750 nm吸收峰的变化;

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