[发明专利]基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针、组合物及提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法

权利要求书

1.基于核酸外切酶Ⅲ的功能化发夹探针，其特征在于：所述功能化发夹探针序列如SEQID No.1所示，该功能化发夹探针包括G-四链体片段和3’凹陷末端区域，其空间二级结构如：其中，区域Ⅰ为G-四链体序列，区域Ⅱ为目标基因结合序列。

2.包含权利要求1所述的功能化发夹探针的检测组合物，其特征在于：还包括引物、DNA聚合酶、核酸外切酶Ⅲ和氯化血红素溶液。

3.根据权利要求2所述的包含功能化发夹探针的检测组合物，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID No.2所示，DNA聚合酶为Klenow Fragment。

4.利用权利要求2或3所述的包含功能化发夹探针的组合物提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将发夹探针、引物以及梯度浓度的Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育1小时后，再加入5 U DNA聚合酶、10 mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，37℃孵育2小时，然后加热使酶失活；

（2）经过步骤（1）处理的溶液冷却至室温，加入100 U核酸外切酶Ⅲ，37℃孵育1小时，然后加热使酶失活；

（3）经过步骤（2）处理的溶液冷却到室温时，加入氯化血红素溶液，37℃孵育35-40分钟；

（4）向经步骤（3）处理的溶液里加入HEPES缓冲液、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10-15分钟后，采用紫外可见分光光度计检测350-750 nm吸收峰的变化；

（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；

（6）将以双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列分别作为目标物，检测灵敏度。

5.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（1）中发夹探针的浓度为1-10 μM、引物的浓度为1-10 μM、Pax-5a的标准溶液的梯度浓度为10 μM，1 μM，100nM，10 nM，1 nM，100pM，10pM，0 pM。

6.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（1）中发夹探针、引物、Pax-5a的标准溶液、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸的量分别为：2 μL、2 μL、1 μL、0.4 μL和1 μL。

7.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（2）中核酸外切酶Ⅲ的加入量为2μL。

8.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（3）中氯化血红素溶液的浓度为50 μM、加入量为2mL。

9.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（4）中HEPES缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.2，加入量为96 μL；双氧水的浓度为20mM，加入量为10 μL；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为10mM，加入量为10 μL。

10.根据权利要求4所述的提高检测Pax-5a基因灵敏度的方法，其特征在于：所述步骤（6）中双碱基错配序列、四碱基错配序列、六碱基错配序列和完全错配序列是分别对Pax-5a基因的两个、四个、六个或全部序列进行错配设计。