[发明专利]一种检测人附睾分泌蛋白4的化学发光试剂盒

权利要求书

1.一种检测人附睾分泌蛋白4的化学发光试剂盒，其特征在于，包括吖啶酯标记69-G10-B8-G8检测抗体、生物素标记9-C3-D12-B1捕获抗体；

所述吖啶酯标记69-G10-B8-G8检测抗体是将单克隆抗体69-G10-B8-G8通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体69-G10-B8-G8是由杂交瘤细胞株69-G10-B8-G8分泌获得；

所述生物素标记9-C3-D12-B1捕获抗体是先将单克隆抗体9-C3-D12-B1利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体9-C3-D12-B1是由杂交瘤细胞株9-C3-D12-B1分泌获得；

所述杂交瘤细胞株9-C3-D12-B1保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2019288；所述杂交瘤细胞株69-G10-B8-G8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2019289；

所述杂交瘤细胞株69-G10-B8-G8和杂交瘤细胞株9-C3-D12-B1的筛选配对获得的具体方法如下：

S1、人工合成人附睾分泌蛋白4基因，将人附睾分泌蛋白4基因重组到表达载体质粒pATX1中，得到HE4-pATX1表达载体；克隆位点为EcoRI/XhoI，人附睾分泌蛋白4基因的基因序列如SEQ NO.1所示；

S2、将HE4-pATX1表达载体转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人附睾分泌蛋白4；

S3、用人附睾分泌蛋白4免疫若干小鼠，共免疫至少4次，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，得到若干株杂交瘤细胞株；

S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人附睾蛋白4的标准品、质控品；

S5、选择步骤S4所得任一种吖啶酯标记的检测抗体、任一种生物素标记的捕获抗体进行配对，再与含有人附睾蛋白4的溶液同时加至孵育槽中孵育，再通过清洗、磁性分离，得到若干组双抗体夹心复合物；加入化学发光底物液测定各组的发光强度，筛选出最佳配对的吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的检测抗体，即获得对应的最佳配对的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S4中，杂交瘤细胞株分泌的抗体进行吖啶酯标记的具体方法为：

S411、取吖啶酯使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度3mg/ml，得吖啶酯溶液；

S412、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝9.0，终浓度2-5mg/ml，得抗体溶液Ⅰ；

S413、按每mg抗体加14ul吖啶酯溶液的比例，将吖啶酯溶液和抗体溶液Ⅰ于25℃避光搅拌2小时；

S414、加入赖氨酸终止反应，25℃避光搅拌0.5小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得吖啶酯标记的检测抗体；

杂交瘤细胞株分泌的抗体进行生物素标记的具体方法为：

S421、生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，得生物素溶液；

S422、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液Ⅱ；

S423、按每mg抗体加5ul生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液Ⅱ于室温避光搅拌2小时；

S424、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；

S425、步骤S424所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，25℃避光搅拌2小时，得生物素标记的检测抗体。

3.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S5中，吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体配对的方式为十字交叉法配对。

4.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S5中，清洗和磁性分离的方式为：对孵育后的产物溶液施加外加磁场，然后吸去上清液，用pH值7.4的含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液清洗缓冲液清洗3次，继续吸去上清液，去除外加磁场后即得到双抗体夹心复合物。

5.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S2中培养的时间为6天。