[发明专利]一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法

说明书

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法。通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。本发明可以实现在海水养殖现场对轮虫弧菌精确、快速的检测，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。

技术领域

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法。

背景技术

轮虫弧菌是一种被新兴的海水养殖病原，可感染鱼、虾等各类海水养殖生物而发病。最早有关轮虫弧菌的报道始是在2003年，由Gomez-Gil等(2003)在褶皱臂尾轮虫中分离得到，此后Chowdhury(2011)和Labbate(2011)等国外学者陆续开展了轮虫弧菌致病机理及生理生化特性等方面的研究。近几年来，国内学者分别在养殖半滑舌鳎(陈政强等,2012)、南美白对虾(金春英等,2013)、线纹海马(杨求华等,2017)和许氏平鲉(王凯等，2018)中分离出了轮虫弧菌。感染轮虫弧菌的半滑舌鳎主要症状为体表溃烂、尾部出血；南美白对虾主要症状为体表发红、肌肉白浊、鳃部变黄溃烂；而许氏平鲉的主要症状为体表出现创伤性溃疡、鳍条溃烂、眼球突出等。因其没有宿主特异性，轮虫弧菌已经成为危害海水养殖产业健康发展的新发病原之一。

值得一提的是，轮虫弧菌在TCBS培养基上生长的菌落为绿色，区别于绝大多数弧菌的黄色菌落，说明其不发酵蔗糖，无法采用TCBS培养基对其进行定性鉴定。因此，研究其特异性的检测方法就成为有效防控轮虫弧菌感染急需突破的关键技术之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是轮虫弧菌因为没有宿主特异性，已经成为危害海水养殖产业健康发展的新发病原之一。而且其不发酵蔗糖，无法采用TCBS培养基对其进行定性鉴定。所以，目前缺乏一种针对轮虫弧菌的特异性检测方法。

为解决上述问题，我们提供了一种准确鉴别轮虫弧菌的特异性引物及其应用方法，可以实现在海水养殖现场对轮虫弧菌精确、快速的检测，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。

进一步的，所述特异性引物是基于轮虫弧菌toxR基因设计的，分别为DNA正向序列VRF:5'-TCGCAGCTTAGAACAACAAT-3'和反向序列VRR:5'-CTCAATAGCGGCATCAGAAA-3'；运用该特异引物扩增的toxR基因的目的片断长度为500bp。

这两个引物序列是我们测定轮虫弧菌的全基因组序列后，通过对基因组数据的分析，筛选toxR基因的部分序列作为目标片段，用生物学软件设计不同的特异引物，通过PCR反复验证后获得的两对特异性最好的引物。toxR是弧菌科的祖先基因，广泛分布在弧菌科细菌，主要起毒力基因表达调控的作用。很多文献表明，在副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、拟态弧菌(Vibrio.mimicus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等很多弧菌中发现toxR基因的存在，是一种非常有效的弧菌属鉴定标记。

进一步的，用于检测的PCR反应体系为通过冷冻真空干燥法提前冻干封装的8μL微量预混PCR反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H₂O。