[发明专利]一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法

权利要求书

1.一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。

2.如权利要求1所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：所述特异性引物是基于轮虫弧菌toxR基因设计的，分别为DNA正向序列VRF:5'-TCGCAGCTTAGAACAACAAT-3'和反向序列VRR:5'-CTCAATAGCGGCATCAGAAA-3'；运用该特异引物扩增的toxR基因的目的片断长度为500bp。

3.如权利要求1或2所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：用于检测的PCR反应体系为通过冷冻真空干燥法提前冻干封装的8μL微量预混PCR反应体系，含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H₂O。

4.如权利要求3所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：所述预混PCR反应体系的制备方法包括以下步骤：

(1-1)首先在200μL的PCR反应管中制作8μL的PCR微量反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBRGREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H₂O，共计8μL；

(1-2)将装有上述8μL微量反应体系的PCR管在-80℃的超低温冰箱预冻1小时候后，再用冷冻真空干燥法冻干，形成预混反应体系，将PCR管盖好后用封口膜封装备用。

5.如权利要求1或2所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法包括以下步骤：

(2-1)剪取养殖动物0.2-0.3g待检测部位组织置于1.5mL离心管中，用研磨棒研磨碎后，加入200μL组织裂解液和300μL无RNAse H₂O；

(2-2)将上述装有样品的离心管置于掌心中并握拳，在人体温条件下使组织充分裂解，然后用掌式离心机离心，获取上清液；

(2-3)吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL无RNAse H₂O对上清进行稀释，震荡混匀后即作为待检测的核酸模板；

(2-4)在提前冻干封装的预混反应体系中加入2μL(2-3)中制备好的核酸模板，和8μL的无RNAse H₂O，充分震荡均匀，形成PCR反应体系；

(2-5)将(2-4)得到的PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；PCR程序结束后进行产物荧光检测；

(2-6)反应芯片中的产物有荧光出现，证明被检测样品中含有轮虫弧菌，根据荧光的激发强度可以定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。

6.如权利要求5所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：步骤(2-5)为将(2-4)得到的PCR反应体系用移液枪转移至PCR:Chip for GeneChecker反应芯片中，置于GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪中进行荧光定量PCR反应。

7.如权利要求5所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：步骤(2-5)的反应程序为：①95℃预变性30s；②95℃变性10s+60℃退火40s+72℃延伸10s，重复②共30个循环。